鮟鱇魚骨膠原多肽螯合鈣的工藝優化

何云，汪有先，趙淑靜，包建強

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

鮟鱇魚（Lophius litulon），俗稱結巴魚、哈蟆魚、海 哈蟆、琵琶魚等，屬冷溫性底層魚類，常棲伏海底，于世界各大海洋均有分布，如大西洋、太平洋和印度洋。頭大、身小，體柔軟，無鱗，內臟比重大，出肉率低，在加工過程中會產生60%以上[1]的下腳料，魚骨占了腳料的15%[2]。開展對鮟鱇魚骨的精深加工研究可以使鮟鱇魚骨資源得以合理開發利用，從而利于提高其加工的綜合效益及經濟附加值。市面上的補鈣劑主要有三類，分別是有無機鈣、有機鈣和氨基酸鈣。但是無機鈣生物效價低、有機鈣溶解度大易溶失且價格高、氨基酸螯合鈣會產生顏色反應并引發脂肪氧化[3]，且總體利用率不高，逐漸被第四代補鈣產品——膠原多肽螯合鈣[4]代替。膠原多肽螯合鈣作為新型的補鈣劑，可使鈣以離子形式與小肽結合，并借助小肽的轉運、吸收機制，以配合物的形式被小腸吸收，故而顯著促進鈣的利用率，且肽-Ca螯合物吸收速度快且可以減少很多生化過程，節約機體能量消耗[5]。多肽螯合鈣具有生物效價高、吸收快、營養高等優點，具有抗氧化、抗菌、免疫調節、降血脂和降血糖等活性，有很高的開發價值和應用前景，日益成為國內外研宄的熱點[6-7]。

本研究以鮟鱇魚骨為原料，經鹽酸法提取魚骨中鈣源后，胃蛋白酶酶解獲得魚骨多肽，向其加入提取出的鈣源，制備膠原多肽螯合鈣。通過單因素試驗和正交試驗，確定最佳的螯合條件，并對其進行氨基酸分析，旨在為鈣補充劑的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮟鱇魚：舟山興業有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）：北京盈信陽光生物科技有限公司；牛血清、HCl、NaOH、無水乙醇、NaCl等：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

原子吸收分光光度計（TAS-990）、T6新世紀型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；L-8800型氨基酸分析儀：天美（中國）科學儀器有限公司；FOSS8400型全自動凱氏定氮儀：上海瑞玢國際貿易有限公司；Seven2Go型pH計、ME204型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；H1850R型高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9070A型鼓風干燥箱：上海鰲珍儀器制造有限公司；LFP-800T型多功能粉碎機：浙江省永康市紅太陽機電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮟鱇魚骨膠原多肽酶解液的制備

新鮮冷凍的鮟鱇魚→預處理→提取鈣液→離心→酶解→離心→魚骨膠原多肽酶解液

魚骨膠原多肽酶解液的制備：取清洗干凈、脫脂、脫雜蛋白、經80℃鼓風干燥箱烘干9 h的魚骨，粉碎后過60目篩，用6.0%鹽酸浸泡、攪拌、脫鈣（60 min，40℃，料液比 1∶6（mg/m L），脫鈣率達到 31.21%，得鈣液）；胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）酶解[料液比1 ∶15（mg/mL），溫度 40 ℃，時間 4 h，p H 1.0，加酶量6%（質量分數）]，100℃滅酶 5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，70℃條件下活性炭吸附（添加量1%（質量分數）），采用0.22 μm濾膜過濾（0.1 MPa，常溫），濃縮（45℃，0.1 MPa），制得鮟鱇魚骨膠原多肽酶解液。

1.3.2 鮟鱇魚骨膠原多肽螯合鈣的工藝流程

魚骨膠原多肽酶解液→調節螯合條件（溫度、pH、質量比、時間）→螯合→3倍無水乙醇沉淀螯合物→離心（8 000 r/min；10 min），收集沉淀→真空冷凍干燥（-108 ℃[16]，4.0 Pa，36 h～48 h）。

1.3.3 檢測方法

鈣含量的測定：火焰原子吸收光譜法（GB5009.92-2016《食品安全國家標準食品中鈣的測定》）。

計算公式如下：

1.3.4 螯合反應單因素試驗

根據單一因素對膠原螯合鈣工藝參數的相關研究，在水系中合成膠原多肽螯合物時，影響合成反應的主要因素有：質量比、pH、螯合時間、螯合溫度等。因此，試驗以質量比、pH、螯合時間、螯合溫度為考察因素。

1.3.4.1 最佳質量比的確定

膠原多肽與鈣離子的結合有一定的配位比，設定pH 6.0、時間50 min、溫度50℃條件下，選擇酶解液中膠原多肽與鈣液的質量比為 0.5 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4∶1，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的質量比。

1.3.4.2 最佳pH值的確定

設定質量比為1∶1、時間50 min、溫度50℃，選擇pH 為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的pH值。

1.3.4.3 最佳螯合時間的確定

設定質量比為1∶1、pH 6.0、溫度50℃，選擇時間為 30、40、50、60、70 min，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的螯合時間。

1.3.4.4 最佳螯合溫度的確定

設定質量比為 1 ∶1、pH 6.0、時間 50 min，選擇溫度為 30、40、50、60、70 ℃，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標確定最佳的螯合溫度。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以膠原多肽與鈣液質量比、pH值、螯合時間、螯合溫度為影響因素，各選取3個水平，采用L9（34）試驗設計，以螯合率和螯合物中的鈣含量為指標，確定鮟鱇魚骨螯合鈣的最佳工藝條件。試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗設計表Table 1 Orthogonal experimental design

1.3.6 螯合物中氨基酸組成成分分析

用氨基酸分析儀測定樣品氨基酸組成。取0.500 0 g的鮟鱇魚骨膠原多肽螯合鈣凍干粉樣品，加入10 mL，6 mol/L HCl，加入3～4滴苯酚，水解管放入冷凍劑中3 min～5 min，吹氮氣后封口，在110℃的恒溫鼓風干燥箱內水解22 h，過濾，再溶解并定容至50 mL容量瓶。吸取1.0 mL作為測定氨基酸組成用的分析樣。

1.3.7 數據處理

所有指標均重復測定3次，采用Origin 8.0和Excel2003進行作圖，用SPASS 19.0進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 膠原多肽與鈣液質量比對螯合反應的影響

膠原多肽與鈣液質量比對螯合反應的影響見圖1。

圖1 酶解液中膠原多肽與鈣液的質量比對螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.1 Effect of protein to calcium solution mass ratio on chelating rate and chelated calcium content

由圖1知，酶解液中膠原多肽與鈣液的質量比對螯合率和螯合物中鈣含量影響顯著。配位體質量過高，肽的利用率下降，配位體過低，螯合物不穩定[8]。在質量比為0.5∶1時，螯合物中鈣含量比較高，螯合率比較低，原因是很多鈣離子未參與螯合反應。隨著質量比的不斷增加，膠原蛋白結合位點的增多，螯合率不斷升高。當質量比達到2∶1后，螯合率最高，說明配體質量比的增大有利于螯合反應的充分進行。當配體的質量比大于2∶1后，鰲合率降低，說明有多余的膠原多肽未被螯合，造成膠原多肽浪費。劉永等[9]優化羅非魚鱗膠原蛋白肽鈣螯合物的制備工藝時發現，螯合率隨肽與氯化鈣質量比的增加而迅速增加，在3∶1時達到最高，繼續升高二者比例，螯合率降低。

2.2 螯合pH值對螯合反應的影響

螯合pH值對螯合反應的影響見圖2。

圖2 pH值對螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.2 Effect of pH on chelating rate and chelated calcium content

由圖2可知，pH對于螯合率和螯合物中鈣含量影響顯著，酸性條件和堿性條件下螯合率和螯合物中鈣含量均相對較低。其原因是在低pH條件下，溶液中H＋大量存在時，H＋會與Ca2＋爭奪供電子基團，呈競爭關系，羧基配位能力較弱，不利于螯合物的形成[10]；而在高pH條件下，OH－與供電子基團爭奪鈣離子而形成氫氧化鈣沉淀[11]，經無水乙醇洗后被除去。在弱酸、弱堿及中性條件下，配體受H＋和OH－影響較小，提供了充分的供電子基團，從而有利于鈣通過配位鍵形成螯合物[12]，與丁利君等[13]研究結果相似，在pH值影響下螯合率均呈現先增加后減小趨勢。

2.3 螯合溫度對螯合反應的影響

螯合溫度對螯合反應的影響見圖3。

由圖3可知，隨著溫度的升高，膠原多肽螯合率呈增大趨勢，40℃之后呈降低趨勢，螯合物中鈣含量先緩慢減少，40℃之后緩慢增加。夏光華等[14]研究發現螯合反應屬于放熱反應，溫度過高不利于螯合反應的進行，故而在溫度過高的情況下，螯合率呈下降趨勢。螯合物中鈣含量下降可能是因為溫度超過一定值，使膠原多肽螯合鈣發生部分分解，多肽螯合鈣是通過多肽的N-端氨基、C-端羧基、氨基酸側鏈以及肽鏈中的殘基和亞氨基與Ca2＋配位形成，此外，多肽對鈣還有吸附作用[15]，故而螯合物中鈣含量增加。

圖3 溫度對螯合率和螯合物中鈣含量的影響Fig.3 Effect of chelating temperature on chelating rate and chelated calcium content

2.4 螯合時間對螯合反應的影響

螯合時間對螯合反應的影響見圖4。

由圖4可知，螯合時間在30 min～50 min時，隨著時間的延長，螯合率和螯合物中鈣含量不斷升高，隨后螯合率和螯合物中鈣含量不斷下降，可能在開始階段，螯合時間短，反應不徹底，游離鈣和配體充足；隨著螯合時間延長，已經螯合的膠原多肽螯合鈣發生了解離，螯合率和螯合物中鈣含量不斷下降，可能由于羰基與氨基發生了羰氨反應，減少了可以與鈣發生螯合的羰基和氨基的數量[16]，此結果與趙妍嫣等研究結果相符[17]。

圖4 螯合時間對螯合率速率的影響Fig.4 Effect of time on chelating rate and chelated calcium content

2.5 正交試驗設計與結果分析

單因素試驗最佳工藝參數：膠原多肽與鈣液質量比 1 ∶1，2 ∶1，3 ∶1，pH 4～6，螯合時間 30 min～50 min，溫度30℃～50℃。根據單因素試驗結果，選定各因素較佳條件進行正交試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2L9（34）正交試驗Table 2L9（34）orthogonal experiment analysis

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

以鰲合率為指標影響鮟鱇魚骨膠原多肽螯合反應的主次順序為：pH（D）＞螯合溫度（C）＞螯合時間（B）＞質量比（A），優化工藝后最佳工藝組合為A2B3C1D3，即質量比2∶1，螯合時間50 min，螯合溫度30℃，pH 6，其主體間效應的檢驗顯示A、B、C、D間差異性顯著。以螯合物中鈣含量為指標影響鮟鱇魚骨膠原多肽螯合反應的主次順序為：pH（D）＞質量比（A）＞螯合時間（B）＞螯合溫度（C），優化工藝后最佳工藝組合為A1B3C2D3，即提質量比 1∶1，螯合時間 50 min，螯合溫度40℃，pH 6，其主體間效應的檢驗顯示 A、B、C、D 間差異性顯著。

表4 驗證試驗結果Table 4 Experiment results of verification

通過調整試驗方案，在A2B3C1D3條件下，鰲合率為98%，螯合物中鈣含量為21.29%，在A1B3C2D3條件下進行試驗，鰲合率為97.17%，螯合物中鈣含量為20.98%。由試驗結果知，A2B3C1D3條件下鰲合率最大為98%，且螯合物中鈣含量最高為21.29%，故其最優工藝組合為：A2B3C1D3即膠原多肽與鈣液質量比2∶1，螯合時間50 min，螯合溫度30℃，pH 6。此結果略高于楊燊[18]、陸劍鋒[19]、黃薇等[20]分別對南海低值魚蛋白、斑點叉尾鮰魚骨膠原多肽、鱈魚皮復合肽與鈣的螯合率，且螯合物中的鈣含量高于彭巧云等[21]的研究結果。產生這種差異的原因，可能是由于原料種類、膠原多肽的氨基酸組分、膠原多肽分子質量等不同，導致最佳螯合條件不同，使其螯合率及螯合物中鈣含量高低不同。

2.6 膠原多肽螯合鈣的氨基酸組成分析

在優化條件下制備的膠原多肽螯合鈣經酸解后，進行氨基酸組成成分分析，測定結果如表5所示。

表5 螯合鈣中氨基酸組分Table 5 Amino acid composition of calcium-chelating collagen polypeptide

螯合鈣中的未檢測到色氨酸，酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸含量較少，谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸含量較多其中脯氨酸與羥脯氨酸含量約占總氨基酸含量的17.37%，符合膠原多肽的氨基酸組成[22]。

3 結論與討論

本試驗首次選用鮟鱇魚骨制備膠原多肽，并與鈣進行螯合，得到既能夠補充人體膠原多肽，又能補充人體鈣的膠原多肽螯合鈣。通過單因素和四因素三水平正交優化試驗，得到膠原多肽液和鈣離子的最佳螯合條件為：溫度30℃、pH6、時間50 min，膠原多肽與鈣的配比為2∶1，此條件下的鈣螯合率為98%，螯合物中鈣含量為21.29%。

對螯合物進行氨基酸分析，具有典型的膠原多肽氨基酸組成特征。紅外光譜分析表明膠原多肽的氨基和羧基都與鈣發生了配位、離子結合，膠原多肽與鈣進行了成功的螯合。電鏡掃描分析表明部分鈣離子吸附在膠原多肽上，說明膠原多肽與鈣離子也有一定的吸附作用。

膠原多肽螯合鈣是由魚骨膠原多肽與鈣離子螯合而成，在螯合過程中膠原多肽除了與鈣離子發生螯合作用外，同時還存在其他一些羰氨反應等，若發生羰氨會減少與鈣離子螯合的膠原多肽基團。膠原多肽螯合鈣的功能性、毒性、溶解性、穩定性和不同分子質量的吸收性，可能因不同膠原多肽分子量不同而不同，以及膠原多肽螯合該的氨基酸組成序列，均可作為下一步研究的重點。