高效液相色譜法測定衢枳殼中新橙皮苷及柚皮苷

（浙江省果品質量檢驗中心，浙江常山324200）

衢枳殼為蕓香科植物常山胡柚[1-3]（citrus chang shan-huyou）的干燥未成熟果實，主產(chǎn)浙江，7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥制成，有衢枳殼、麩炒衢枳殼、麩衢枳殼、蜜衢枳殼、衢枳殼炭5種飲片。2015版《浙江省中藥炮制規(guī)范》修訂后，將“常山胡柚片”收錄其中，并正式命名為“衢枳殼”。衢枳殼味苦、辛、酸，性微寒，歸脾、胃經(jīng)，有理氣寬中、行滯消脹功效，可用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內停、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥[4-7]。2018年，衢枳殼與鐵皮石斛、靈芝、西紅花等浙江省內知名中藥材一并入選新“浙八味”中藥材培育品種名單。

新橙皮苷及柚皮苷是衢枳殼的主要活性成分[8-11]，其含量的高低直接影響衢枳殼的功效，因此測定衢枳殼中兩種功能成分的含量具有重要意義。

建立高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定衢枳殼中的新橙皮苷及柚皮苷的方法，對加強“衢枳殼”有效物質研究，保障藥材質量安全，規(guī)范市場秩序、促進“衢枳殼”產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展、推動胡柚產(chǎn)業(yè)轉型發(fā)展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Waters e2695高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；Thermo u3000液相色譜儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；VARIAN液相色譜儀：瓦里安公司；HH-4恒溫水浴鍋：江蘇常州國華電器有限公司；XS105DU分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ2200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；超純水器：杭州永潔達凈化科技有限公司。新橙皮苷對照品（純度：98.76%）、柚皮苷對照品（99.33%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；衢枳殼：常山縣柚王中藥材有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）、磷酸（分析純）：國藥集團；水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（20 ∶80）（用磷酸調節(jié) pH 值至 3.0）；檢測波長為 283 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

1.3 標準液的制備

1.3.1 新橙皮苷儲備液的配制

精密稱取干燥至恒重的新橙皮苷對照品19.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.91 mg/mL的新橙皮苷儲備液，2℃～8℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r取出放至室溫。

1.3.2 柚皮苷儲備液的配制

精密稱取干燥至恒重的柚皮苷對照品19.5 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.95 mg/mL的柚皮苷儲備液，2℃～8℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r取出放至室溫。

1.3.3 新橙皮苷柚皮苷混合對照品溶液的配制

精密吸取新橙皮苷儲備液和柚皮苷儲備液各1 mL至25 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得含新橙皮苷74.6 μg/mL、柚皮苷78.0 μg/mL的混合標準溶液。

1.4 供試品溶液的制備[12-16]

取衢枳殼粗粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2 結果與分析

2.1 HPLC圖譜

分別將新橙皮苷儲備液和柚皮苷儲備液以甲醇稀釋至約80 μg/mL進樣，得到新橙皮苷色譜圖和柚皮苷色譜圖；將新橙皮苷柚皮苷混合對照品溶液進樣，得到新橙皮苷柚皮苷混標色譜圖；供試品按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理進樣，得到供試品色譜圖。結果如圖1。

結果顯示，在此色譜條件下，新橙皮苷與柚皮苷分離較好，專屬性高。

2.2 線性范圍

分別精密吸取新橙皮苷儲備液和柚皮苷儲備液適量，依次配制成含新橙皮苷和柚皮苷分別為①305.6 μg/mL，312.0 μg/mL②152.8 μg/mL，156.0 μg/mL③76.4 μg/mL，78.0 μg/mL④38.2 μg/mL，39.0 μg/mL⑤19.1 μg/mL，19.5 μg/mL 的系列混合對照品溶液，10 μL進樣。相當于新橙皮苷和柚皮苷質量依次為①3.056 μg，3.12 μg ②1.528 μg，1.560 μg ③0.764 μg，0.780 μg④0.382 μg，0.390 μg ⑤0.191 μg，0.195 μg。檢測峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程分別為：Y=19 400X+32 700（R2=0.999 9）和 Y=14 300X+27 200（R2=0.999 9）。結果表明，新橙皮苷在 0.191 μg～3.056 μg、柚皮苷在 0.195 μg～3.120 μg質量濃度范圍內呈良好的線性關系。

圖1 新橙皮苷與柚皮苷含量測定的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of neohesperidin and naringin

2.3 穩(wěn)定性試驗

取同一批供試品按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理后，在室溫25℃下放置，分別按前述色譜條件在0、24、48 h進樣，根據(jù)樣品溶液中新橙皮苷和柚皮苷的峰面積，考察溶液的穩(wěn)定性，計算相對標準偏差RSD，計算結果如表1。

表1 穩(wěn)定試驗結果Table 1 Results of stability test

以上試驗結果表明，供試品溶液中新橙皮苷和柚皮苷均在48 h內穩(wěn)定。

2.4 精密度試驗

將新橙皮苷柚皮苷混合對照品溶液，重復進樣5次，根據(jù)峰面積，計算相對標準偏差RSD，計算結果如表2。

表2 精密度試驗結果Table 2 Results of precision test

結果表明進樣精密度RSD均小于3.0%，符合測定要求。

2.5 回收率試驗

供試品溶液的制備：精密稱取已知含量的供試品0.2 g，精密加入一定量對照品，使對照品加入量與所取供試品中待測定成分質量之比在1∶1左右，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理進樣。平行制備6份供試品。計算結果如表3、表4。

表3 新橙皮苷回收率試驗結果Table 3 Results of recovery test for neohesperidin

表4 柚皮苷回收率試驗結果Table 4 Results of recovery test for naringin

回收率/%=（實測量-供試品所含被測成分量）/加入對照品量×100

2.6 重復性試驗

取同一批供試品6份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理進樣，得到測定結果，計算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對標準偏差RSD，結果如表5。

表5 重復性試驗結果Table 5 Results of repeated test

結果表明，該方法測定樣品的含量，重復性好。

2.7 中間精密度

取同一批供試品3份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理后，于連續(xù)3天內分別進樣，計算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對標準偏差RSD，結果如表6。

表6 不同日期中間精密度試驗結果Table 6 Results of inter-assay precision of different days

由3名不同試驗人員取同一批供試品3份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理后進樣，計算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對標準偏差RSD，結果如表7。

表7 不同人員中間精密度試驗結果Table 7 Results of inter-assay precision of different persons

同一批供試品3份，按照“1.4供試品溶液的制備”方法處理，采用相同的色譜條件，注入不同的液相色譜儀（Waters e2695液相色譜儀、Thermo u3000液相色譜儀、VARIAN液相色譜儀）。計算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相對標準偏差RSD，結果如表8。

表8 不同儀器中間精密度試驗結果Table 8 Results of inter-assay precision of different instruments

結果顯示，供試品在不同日期內處理進樣、由不同試驗人員進行樣品處理或采用不同儀器分析中間精密度均小于3%，方法受隨機變動因素的影響小。

2.8 耐用性

對不同品牌色譜柱、不同柱溫、不同流速及不同比例流動相進行考察。色譜柱：采用Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CNW Athena C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3個不同品牌色譜柱進樣，理論塔板數(shù)、分離度等均能達到要求。結果見表9。

表9 不同品牌色譜柱考察系統(tǒng)適應性參數(shù)Table 9 Results of system adaptability test of different chromatographic column

柱溫：設置25、27、30℃3個不同柱溫條件進樣，結果見表10。

表10 不同柱溫考察系統(tǒng)適應性參數(shù)Table 10 Results of system adaptability test of different column temperature

流速：設置0.8、1.0、1.2 mL/min 3個不同流速條件進樣，表11。

表11 不同流速考察系統(tǒng)適應性參數(shù)Table 11 Results of system adaptability test of different flow rate

流動相：采用乙腈-水（20∶80）（用磷酸調節(jié)pH值至 3.0）、乙腈-水（21 ∶79）（用磷酸調節(jié) pH 值至 3.0）、乙腈-水（19∶81）（用磷酸調節(jié)pH值至3.0）3個不同比例流動相條件進樣。結果見表12。

表12 不同比例流動相考察系統(tǒng)適應性參數(shù)Table 12 Results of system adaptability test of different mobile phase ratio

結果顯示，在各考察條件下理論塔板數(shù)、分離度等均能達到要求，因此方法在所考察因素有小的變動時，結果不受影響。綜合考慮，選擇Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱作為此方法常用檢測色譜柱、流動相比例為乙腈-水（20∶80）（用磷酸調節(jié)pH值至3.0）、柱溫 25℃、流速 1.0 mL/min。

3 結論

建立HPLC同時測定衢枳殼中新橙皮苷及柚皮苷的測定方法。橙皮苷及柚皮苷含量為5.6%和7.6%（以干燥品計），該方法簡便、準確、重復性好，可用于衢枳殼中新橙皮苷及柚皮苷的含量測定。