丙烯醛氧化修飾對核桃蛋白結構和乳化特性的影響

孫領鴿，王丹丹，毛曉英*，詹 萍，田洪磊

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

在食品科學領域，蛋白質氧化是指蛋白質分子受活性氧直接攻擊，或與次生氧化產物間接反應而發生的共價結構修飾[1]。蛋白質氧化會導致蛋白質主鏈發生斷裂、氨基酸殘基側鏈發生氧化修飾以及形成蛋白質分子間交聯物[2]，從而引起食品營養成分損失、品質下降。在自然條件或高溫、高壓、輻照等加工條件下，食品中含有的不飽和脂肪酸、色素、金屬離子、酶等成分均能夠誘導蛋白質發生氧化。近年來，蛋白質氧化對食品營養成分和品質的影響成為國內外學者的研究熱點。盧巖等[3]研究發現羥自由基氧化能使大豆蛋白產生共價交聯；劉晶等[4]研究發現高濃度的丙二醛能夠使大豆蛋白持水性、乳化性等功能性質下降。

核桃被稱為世界四大堅果之一[5]，營養物質豐富且含量均衡[6]，具有極高的營養價值和保健功效。核桃中油脂含量占50%以上[7]，且以多不飽和脂肪酸為主。在自然條件和加工過程中，核桃中的脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）誘導多不飽和脂肪酸發生脂質過氫化反應產生的脂質自由基或脂質活性氧化產物（包括脂質氫過氧化物、活性醛類等）能夠誘導蛋白質發生氧化。與自由基和脂質氫過氧化物相比，活性醛類因其結構比較穩定能夠導致更大程度的蛋白質氧化。在脂質過氧化反應所產生的α,β-不飽和醛中，丙烯醛的反應活性最強，能夠使蛋白質發生共價交聯[8]。此前關于丙烯醛對蛋白質結構和功能性質影響的研究報道主要集中在動物蛋白和大豆蛋白。如李學鵬等[9]采用丙烯醛溶液對大黃魚魚肉進行體外氧化模擬，研究發現丙烯醛能夠破壞大黃魚肌肉組織結構并引起肌原纖維蛋白氧化；Wu Wei等[10]采用不同濃度的丙烯醛氧化大豆蛋白，發現丙烯醛氧化修飾使得大豆蛋白發生交聯，蛋白結構發生變化。而關于丙烯醛氧化對核桃蛋白結構和功能性質的影響鮮見報道。目前，關于大豆等植物性原料在貯藏和加工過程中由LOX催化的脂質過氧化反應是導致植物蛋白質結構性氧化修飾從而造成其功能性質下降的主要原因基本得到了廣泛共識。然而，關于蛋白質結構性氧化修飾對其功能性產生的影響機理尚不清楚。

乳化性作為核桃蛋白加工過程中重要的功能指標，是影響核桃蛋白產品品質穩定性的關鍵因素。影響核桃蛋白乳化特性的因素有很多。趙潤澤等[11]研究發現烘烤處理會使核桃蛋白乳化穩定性下降；Tapal等[12]利用姜黃素提高大豆蛋白乳化性。而蛋白質的種類和結構是影響蛋白質乳化性的關鍵因素。因此，本實驗以丙烯醛代表LOX催化的脂質過氧化反應產生的次生產物，采用不同濃度（0～1 mmol/L）的丙烯醛溶液氧化核桃蛋白，以氧化后核桃蛋白的羰基含量、巰基含量、溶解度、表面疏水指數和圓二色光譜表征核桃蛋白結構，乳化性和乳化穩定性表征核桃蛋白乳化特性，以研究LOX催化的脂質過氧化反應次生產物的活性醛對核桃蛋白結構和乳化特性的影響機理，為核桃蛋白產品在加工及貯藏過程中品質控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

和田產薄皮核桃購于新疆石河子市農貿市場；丙烯醛（分析純） 山東西亞化學工業有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LGJ-18S冷凍干燥機 北京松源華興科技有限公司；PHS-3C雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；MULTIFUGE X1R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；F-7000熒光光譜儀 日本日立公司；ELE高速均質剪切機 上海易勒機電設備有限公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Biologic公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃分離蛋白的制備

以當年收獲的和田薄皮核桃為原料，參照毛曉英[13]的方法采用堿溶酸沉法制備核桃分離蛋白。采用正己烷對脫皮后的核桃仁進行脫脂得到脫脂核桃粉。將脫脂核桃粉用95%乙醇溶液（料液比1∶10）進行醇洗，過濾得到濾餅后揮干溶劑，用去離子水（料液比1∶26）溶解得到蛋白質溶液。調節蛋白質溶液pH值為11，攪拌離心得到上清液。調節上清液pH值為4.5，攪拌離心得到沉淀，調節蛋白質沉淀pH值至中性用冷凍干燥機凍干24 h，即得到核桃分離蛋白。

1.3.2 丙烯醛氧化核桃蛋白的制備

根據Wu Wei等[10]的方法，略修改。用0.01 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液溶解核桃分離蛋白，加入一定量NaN3以防止微生物滋生。將丙烯醛與核桃蛋白溶液混合，使得丙烯醛在核桃蛋白溶液中的濃度分別為0、0.001、0.01、0.1 mmol/L及1 mmol/L。將含有丙烯醛的核桃蛋白溶液在25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩反應24 h，反應過程中注意避光。反應結束后將核桃蛋白溶液在4 ℃去離子水中透析72 h，透析過程中要及時更換去離子水。最后將透析后的溶液冷凍干燥得到氧化核桃蛋白。

1.3.3 核桃蛋白羰基含量的測定

采用2,4-二硝基苯肼法[14]測定羰基含量。

1.3.4 巰基含量的測定

參照Huang Youru等[15]的方法。對照組不加5,5’-二硫雙（2-硝基苯甲酸），在波長412 nm處測定上清液的吸光度，巰基含量用13 600 L/（mol?cm）消光系數進行計算。

1.3.5 溶解度的測定

根據葉林[16]的方法，略修改。將核桃蛋白樣品溶于去離子水中，磁力攪拌1 h，離心后取上清液測定波長540 nm處吸光度。以牛血清白蛋白作標準曲線。溶解度為樣品蛋白質含量和溶液蛋白質含量的比值。

1.3.6 表面疏水指數的測定

采用ANS作為熒光探針[15]。核桃蛋白樣品溶于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中，使得蛋白溶液質量濃度在0.005～0.5 mg/mL之間。取50 μL濃度為8 mmol/L ANS溶液加入4 mL不同濃度的稀釋樣品中。激發波長和發射波長分別為365 nm和484 nm。以蛋白質質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，蛋白質分子表面疏水指數為蛋白質質量濃度為0時得到的斜率。

1.3.7 圓二色光譜的測定

根據吳偉[17]的方法，略修改。用去離子水溶解核桃蛋白樣品使蛋白質量濃度為50 μg/mL，掃描核桃蛋白樣品在波長190～250 nm之間的圓二色光譜。掃描3 次得到平均值，以去離子水作為空白組。

1.3.8 乳化性和乳化穩定性的測定

參考Pearce等[18]方法，略修改。將一定量核桃蛋白樣品溶解于去離子水中，取9 mL蛋白質溶液加入3 mL大豆油，用均質機以10 000 r/min均質2 min后在0 min和10 min時取乳狀液5 μL溶于0.1%十二烷基硫酸鈉溶液中混勻，在波長500 nm處測定吸光度分別記為A0和A10。以0.1%十二烷基硫酸鈉溶液為空白。乳化性和乳化穩定性按公式（1）、（2）計算：

式中：A0為均質后0 min測定的吸光度；A10為均質后10 min測定的吸光度；c為蛋白溶液的質量濃度/（g/mL）；φ為油占總乳液的體積分數，0.25。

1.4 數據處理與統計分析

每個指標進行3 次重復實驗，實驗結果用 ±s表示。繪圖采用Origin 8.5軟件，顯著性分析采用SPSS Statisics 23.0單因素ANOVE中的Dukeny檢驗。

2 結果與分析

2.1 丙烯醛氧化對核桃蛋白氧化程度的影響

圖1 丙烯醛氧化對核桃蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of oxidative modification with acrolein on the carbonyl content of walnut protein

蛋白質氧化發生的顯著變化之一就是羰基的形成，用羰基含量表征蛋白質氧化程度已經成為廣泛共識。由圖1可以看出，丙烯醛濃度為0 mmol/L時，核桃蛋白羰基含量為4.287 nmol/mg；隨著丙烯醛濃度增加，核桃蛋白羰基含量顯著增加（P＜0.05）；當丙烯醛濃度為1 mmol/L時，核桃蛋白羰基含量為11.078 nmol/mg，與未氧化的核桃蛋白相比增加了158.41%。Mellon等[19]研究發現當丙烯醛濃度為0.005～50 μmol/L時，突觸體的蛋白質羰基值隨著丙烯醛濃度的增加呈線性增加。這是因為核桃蛋白質中部分氨基酸殘基上的基團與丙烯醛分子中存在的雙鍵發生親核加成反應生成NH3和相應的羰基衍生物[20]。

2.2 丙烯醛氧化對核桃蛋白游離巰基和總巰基含量的影響

圖2 丙烯醛氧化對核桃蛋白巰基含量的影響Fig. 2 Effect of oxidative modification with acrolein on the sulfhydryl content of walnut protein

因蛋白質中的半胱氨酸最容易被氧化修飾，其氧化狀態可反映蛋白質的氧化程度。而半胱氨酸的氧化狀態通常用巰基含量來表征[21]。由圖2可以得出，隨著丙烯醛濃度的增加，核桃蛋白游離巰基和總巰基含量呈下降趨勢；且丙烯醛濃度大于等于0.01 mmol/L時，游離巰基和總巰基含量顯著下降（P＜0.05）。當丙烯醛濃度達到1 mmol/L時，核桃蛋白游離巰基和總巰基含量相比于未氧化的蛋白分別下降55.18%和31.13%。李學鵬等[9]研究發現大黃魚肌原纖維蛋白的游離巰基和總巰基含量隨著丙烯醛濃度的增加而下降。這是因為軟親電試劑丙烯醛與軟親核試劑蛋白質巰基可迅速發生邁克爾加成反應，從而使暴露在外面的游離巰基含量降低[22]。隨著丙烯醛濃度的增加，蛋白質氧化變性伸展使得蛋白質內部的巰基得到釋放進一步與丙烯醛反應，從而使總巰基含量下降。同時研究結果表明丙烯醛氧化使核桃蛋白二硫鍵減少，這是由于丙烯醛氧化使得二硫鍵斷裂，蛋白質構象發生變化。巰基與二硫鍵交互反應的平衡常數受蛋白質氧化修飾的影響[23]，游離巰基和二硫鍵含量同時下降說明丙烯醛氧化使核桃蛋白生成了含硫氧化產物。

2.3 丙烯醛氧化對核桃蛋白溶解度的影響

圖3 丙烯醛氧化對核桃蛋白溶解度的影響Fig. 3 Effect of oxidative modification with acrolein on solubility of walnut protein

溶解度的大小與蛋白樣品的變性和聚集程度有關，是實現蛋白質功能性質的基礎和前提[24]。由圖3可以看出，丙烯醛氧化對核桃蛋白溶解度影響比較大。隨著丙烯醛濃度的增加，核桃蛋白溶解度從9.25%降低到1.48%（P＜0.05）。未氧化的核桃蛋白溶解度比較低是由于溶解性差的谷蛋白占核桃蛋白組成的70%以上且在核桃蛋白的氨基酸組成中主要以酸性氨基酸和疏水性氨基酸為主[13]。Ye Lin等[25]認為氧化導致花生分離蛋白溶解度下降是由于不溶性蛋白質氧化聚集體的形成。核桃蛋白溶解度隨著氧化程度增加而下降的原因可能是核桃蛋白中多肽鏈的親核基團與丙烯醛中的不飽和雙鍵結合發生加成反應，蛋白質上氨基與丙烯醛上的羰基結合發生羰氨反應生成Schiff堿，兩者共同作用使得蛋白質發生共價交聯生成了大量不可溶性聚集體[10]。

2.4 丙烯醛氧化對核桃蛋白表面疏水指數的影響

圖4 丙烯醛氧化對核桃蛋白表面疏水性的影響Fig. 4 Effect of oxidative modification with acrolein on the surface hydrophobicity of walnut protein

蛋白質表面疏水指數能夠衡量蛋白質變性的程度[26]，對蛋白質結構和功能特性有重要的影響[27]。表面疏水指數反映了蛋白質表面疏水性氨基酸的相對含量[26]。由圖4可以看出，核桃蛋白的表面疏水指數隨著丙烯醛濃度的增加顯著下降，從469.47降低至412.22（P＜0.05）。Tamamizu-Kato等[28]也發現丙烯醛氧化能夠降低阿樸脂蛋白的表面疏水性。吳偉等[29]研究結果表明大豆蛋白被氧化后容易發生去折疊反應從而使其表面疏水性降低。丙烯醛氧化使得蛋白質發生變性，蛋白質結構被破壞，內部氨基酸殘基被氧化，原本包藏在蛋白質內部的疏水性基團如芳香族氨基酸被暴露出來，這些暴露出來的疏水基團在疏水相互力的作用下形成氧化聚集體，從而使氧化核桃蛋白的表面疏水性下降；另外，蛋白質羰基等親水基團的形成也是引起蛋白質表面疏水性下降的原因之一[30]。

2.5 丙烯醛氧化對核桃蛋白二級結構的影響

圖5 核桃蛋白樣品圓二色光譜圖Fig. 5 Circular dichroism spectra of walnut protein samples

表1 丙烯醛氧化對核桃蛋白二級結構的影響Table 1 Effect of oxidative modification with acrolein on the secondary structure contents of walnut protein

圓二色光譜技術對檢測溶液蛋白質二級結構十分靈敏[31]。遠紫外圓二色可以用來表征核桃蛋白氧化過程中二級結構的變化。如圖5所示，未氧化核桃蛋白在波長209 nm和222 nm處各存在一個負肩峰，這是因為α-螺旋結構能夠引起負科頓效應[17]，195 nm附近的正峰和200 nm的凹槽說明未氧化核桃蛋白含有β-折疊結構和無規則卷曲結構。隨著丙烯醛濃度的增加，195 nm處的正峰和209、222 nm處負肩峰強度呈現下降趨勢，200 nm處的凹槽強度呈現增強趨勢。通過軟件分析得到氧化核桃蛋白二級結構相對含量，如表1所示。核桃蛋白中含有4 種類型的二級結構，其中以無規則卷曲和α-螺旋結構相對含量居多。隨著丙烯醛濃度的增加，核桃蛋白α-螺旋、β-折疊相對含量減少，同時無規則卷曲和β-轉角相對含量增加。丙烯醛氧化使得核桃蛋白中有序的α-螺旋、β-折疊結構轉變為無序的無規則卷曲和β-轉角結構，核桃蛋白二級結構發生改變。這一結果與吳偉等[32]研究蛋白質氧化對大米蛋白二級結構含量的影響結果一致。Sun Weizheng等[33]認為氧化導致蛋白結構展開使得α-螺旋發生解螺旋，導致有序結構下降。β-折疊結構的變化與蛋白表面疏水性有關[34]，無規則卷曲和β-轉角含量的變化影響蛋白質乳化穩定[35]。

2.6 丙烯醛氧化對核桃蛋白乳化特性的影響

圖6 丙烯醛氧化對核桃蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Fig. 6 Effects of oxidative modification with acrolein on emulsifying capacity and emulsion stability of walnut protein

乳化特性是蛋白質重要的功能性質之一，通常用乳化性和乳化穩定性表征蛋白質的乳化特性[36]。由圖6可以看出，隨著氧化程度的增加，核桃蛋白乳化性和乳化穩定性均呈減小的趨勢。未氧化的核桃蛋白乳化性和乳化穩定性分別為46.87 m2/g和25.93 min；丙烯醛濃度為1 mmol/L時，核桃蛋白乳化性和乳化穩定性分別下降了78.96%和32%（P＜0.05）。說明丙烯醛氧化破壞了核桃蛋白乳化性和乳化穩定性。這一結果與核桃蛋白溶解度和表面疏水指數變化趨勢相符合。李艷青[37]認為蛋白質聚集體的形成是造成其乳化性及乳化穩定性下降的主要原因。丙烯醛氧化導致核桃蛋白乳化性和乳化穩定性的降低，一方面是由于丙烯醛氧化使得蛋白質發生共價交聯而形成的不可溶性蛋白質聚集體使得分子柔韌性降低，蛋白質溶解度和表面疏水性降低，蛋白表面積減小，蛋白膜黏度降低；另一方面是由于氧化使核桃蛋白質結構的完整性被破壞，蛋白質與界面的作用力減弱，蛋白質分子無法再結合到水-油界面形成穩定的界膜。

3 結 論

在核桃貯藏和加工過程中由LOX催化的脂質過氧化反應是導致核桃蛋白質發生結構性氧化修飾的主要途徑。為探究核桃蛋白發生結構性氧化修飾并影響其功能性的機理，本研究以丙烯醛代表脂質氧化產生的次生產物，采用不同濃度的丙烯醛溶液氧化核桃蛋白，研究丙烯醛氧化對核桃蛋白結構和乳化特性的影響。結果表明丙烯醛能夠使核桃蛋白發生顯著氧化，導致核桃蛋白結構的變化。表現在核桃蛋白羰基含量顯著增加；游離巰基和總巰基含量顯著降低；二級結構發生變化，從而使核桃蛋白溶解度和表面疏水性減小，乳化性和乳化穩定性降低。研究結果表明丙烯醛氧化可使核桃蛋白發生結構性修飾，并對其乳化特性產生負面影響。本研究結果為核桃蛋白產品在加工及貯藏過程中品質控制提供參考，并為蛋白氧化過程中脂質氧化產生的次生產物對其結構和功能特性的影響提供理論支持。