陳樹俊,李佳益,王翠連,張君梅,李 樂,石 玥
(山西大學生命科學學院,山西 太原 030006)
高平黃梨是山西著名特產,高平素有梨鄉之稱,距今已有1 500 a的栽培歷史,其個大、味濃、味香、香甜適口,味道鮮美,各種維生素、礦物質含量高,水分大、耐貯運且含糖量很高[1]。隨著梨汁加工產業的發展,勢必會產生越來越多的梨渣,梨渣中含有豐富的多糖,而多糖是生物體重要的生物活性物質,具有調節免疫力[2-3]、抗氧化[4-5]、抑菌[6]、抗腫瘤[7]、降血脂、降血糖[8-9]等作用,因此梨渣可作為提取多糖的主要來源。國內多采用水浴醇沉[10]、超聲[11]等方法提取多糖,利用Sevag法[12]、三氯乙酸法[13]等脫除多糖中的雜質蛋白質,采用H2O2法[14]、活性炭法[15]等方法對多糖進行脫色,采用凝膠滲透色譜法、超高效液相色譜法[16]測定多糖的相對分子質量,氣相色譜法測定其單糖組成以及用紅外光譜法對多糖的結構進行初步分析。楊江濤[17]用凝膠滲透色譜法測定刺梨多糖的相對分子質量為52 000,衛強等[18]用氣相色譜分析法確定紅豆杉多糖中含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、木糖和半乳糖,并通過紅外光譜法鑒定其為一種具有β糖苷鍵的吡喃型多糖。
目前,國內關于高平黃梨的研究鮮見報道。本實驗以高平黃梨渣為原料,利用水浴醇沉法和超聲輔助法提取梨渣多糖,比較Sevag法、酶法、Sevag法和酶法結合3 種方法確定脫蛋白工藝,比較H2O2法、活性炭法、反膠束溶液法3 種方法確定脫色工藝,采用DEAE-52纖維素柱層析方法對多糖進行分級,烏氏黏度法測定黃梨渣多糖的黏均分子質量,超高效液相色譜法對單糖的組成及含量進行分析,并通過紅外光譜對黃梨渣多糖的結構進行初步鑒定。旨在為高平黃梨資源的綜合利用提供一定參考。
高平黃梨渣 山西夏普賽爾食品飲料股份有限公司。
牛血清白蛋白 美國Roche公司;DEAE-52纖維素、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸標準品、三氟乙酸、乙腈(色譜純)、磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)北京Solarbio公司;Sephadex G-100 美國Sigma公司。
WFZ UV-2100型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 佳明儀表公司;電子分析天平 上海卓精公司;超聲波清洗機、真空冷凍干燥箱 寧波新芝生物科技股份有限公司;SENCO旋轉蒸發儀 上海申生有限公司;SC-3610低速離心機、HC-2518高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;烏氏黏度計 上海良晶玻璃儀器廠;1525高效液相色譜儀 美國Waters公司;傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。
1.3.1 梨渣多糖的提取及測定
1.3.1.1 多糖含量的測定
參考文獻[19],以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,得標準曲線方程:y=12.08x-0.039 2,R2=0.999 2。
1.3.1.2 超聲輔助提取工藝優化
精密稱取1 g,適當料液比混勻,超聲輔助熱水浸提,4 000 r/min離心15 min得上清液,旋轉濃縮,加入3 倍體積95%乙醇溶液使得最終乙醇體積分數為80%以上,4 ℃醇沉過夜,4 000 r/min離心15 min得沉淀,干燥后即得粗多糖樣品。
單因素試驗:選取料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL));超聲功率(110、120、130、140、150 W);超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃);超聲時間(40、50、60、70、80 min)進行單因素試驗,考察對梨渣多糖提取量的影響。
響應面法優化試驗:根據Box-Behnken試驗設計原理,以多糖提取量為響應值,結合上述單因素試驗結果,設計4因素3水平響應面試驗。試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in response surface analysis
1.3.2 梨渣多糖脫蛋白
1.3.2.1 蛋白含量的測定
參考文獻[20],以牛血清白蛋白濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,得標準曲線方程為y=6.345x+0.126 7,R2=0.999 6。
1.3.2.2 脫蛋白方法
Sevag法:取一定量的粗多糖溶液,向其中加入1/5體積的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇-氯仿體積比1∶4),磁力攪拌器高速攪拌30 min,8 000 r/min離心20 min,去除沉淀,重復13 次,直至無沉淀產生。測定多糖含量和蛋白含量,按公式(1)、(2)計算蛋白脫除率和多糖損失率:

酶法:向100 mL粗多糖溶液中加入1%木瓜蛋白酶,調節pH 6.0,于50 ℃水浴中加熱保溫2 h,然后4 000 r/min離心15 min得上清液,并按公式(1)、(2)計算蛋白脫除率和多糖損失率。
酶法和Sevag法結合:將酶法所得上清液再用Sevag法脫蛋白,重復操作5 次至無蛋白沉淀,并按公式(1)、(2)計算蛋白脫除率和多糖損失率。
1.3.3 梨渣多糖脫色方法的確定
對梨渣粗多糖溶液進行可見-紫外全波長掃描,根據互補色原理[21]確定檢測波長為450 nm,測定溶液脫色前后吸光度,分別按公式(3)、(4)計算脫色率和多糖損失率:

H2O2法:用2 mol/L的NaOH溶液將脫蛋白后的梨渣多糖溶液調至pH 8.5,緩慢攪拌加入1/5體積的30% H2O2溶液,50 ℃保溫脫色2 h,直至顏色不再改變,取出后冷卻到室溫,調節pH值至7.0左右,并檢測其脫色前后的吸光度和多糖含量。
活性炭法:將活性炭用蒸餾水清洗并過濾,在100 ℃烘箱中干燥20 h備用。取100 mL 5 mg/mL粗多糖溶液,加入3%活性炭,60 ℃水浴脫色2 h,至顏色不再改變,檢測其脫色前后的吸光度和多糖含量。
反膠束溶液法[18]:取脫蛋白后的多糖配制成5 mg/mL的粗多糖溶液50 mL,置于沸水浴中加熱30 min,冷卻至室溫,4 000 r/min離心5 min,取0.234 g NaCl加入20 mL上清液中備用。將1 mL正己醇、4 mL異辛烷和0.274 g十六烷基三甲基溴化銨混合制成反膠束溶液。移取3 mL粗多糖溶液和1 mL反膠束溶液,振蕩3 min后靜置30 min,取下層液體檢測其脫色前后色素吸光度和多糖含量。
1.3.4 梨渣多糖的透析
經過脫蛋白、脫色的梨渣多糖,還會存在單糖、低聚糖和鹽等小分子雜質需要除去,故將脫色后的多糖溶液裝入透析袋于蒸餾水中透析36 h,中間隔斷換水。
1.3.5 梨渣多糖的分級
參考王雪艷[21]采用DEAE-52纖維素柱層析的方法對多糖進行分級。將經過脫蛋白、脫色、透析的多糖溶液濃縮至適當體積,上DEAE-52纖維素柱(2.6 cm×30 cm)進行分級純化,先以20 mL蒸餾水洗脫,然后以0~1 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液進行線性洗脫,流速為1 mL/min,每3 min收集一管,于490 nm波長處以苯酚-濃硫酸法測定吸光度,繪制洗脫曲線,橫坐標為接收管數,縱坐標為吸光度。洗脫液經濃縮、透析、真空冷凍干燥制得精制多糖。
1.3.6 梨渣多糖的純度鑒定
Sephadex G-100凝膠柱層析:稱取10 mg的精制多糖溶于5 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中,加到預先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡的Sephadex G-100凝膠柱上,用0.1 mol/L NaCl溶液進行洗脫,流速為1 mL/min,每3 min收集一管,在490 nm波長處以苯酚-硫酸法測定吸光度,繪制洗脫曲線,橫坐標為接收管數,縱坐標為吸光度。
紫外吸收光譜法:將質量濃度為1.0 mg/mL純化后的多糖溶液于200~500 nm范圍內進行全波長掃描,觀察在260 nm、280 nm波長附近的特征吸收峰。
凍融實驗法:取冷凍過夜后的精制多糖在室溫下融化,12 000 r/min離心15 min,觀察離心管底部沉淀產生情況。
1.3.7 相對分子質量的測定
參照金婷[22]方法。精確稱取梨渣精制多糖樣品0.25 g,用蒸餾水溶解并定容至25 mL容量瓶中,將烏氏黏度計置于25 ℃的恒溫水浴鍋中,在C管和B管的上端套上干燥清潔的橡皮管,從A管沿管壁加入10 mL多糖溶液,恒溫10 min后,測定其流出時間t1。然后依次從A管分別加入10、5、15、10 mL水,將原濃度的溶液稀釋成不同的濃度,分別測定不同濃度時的流出時間t。在檢測樣品的黏度前,先以同樣的方法測定蒸餾水的流出時間t0。每個數據重復測定3 次,偏差應小于0.2 s,取其平均值。分別計算相對黏度ηr、增比黏度ηsp和比濃黏度ηsp/c。橫坐標為多糖溶液的質量濃度c,縱坐標為ηsp/c繪制標準曲線,以外推法求得特性黏度[η]。根據Mark-Houwink公式([η]=KMηα)求得梨渣多糖的黏均分子質量。
1.3.8 單糖組成的測定
酸水解:稱取凍干的多糖樣品2 mg,加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL,在120 ℃條件下水解120 min,氮吹儀吹干。
標準品處理:首先配制10 mg/mL單糖標準品置于-20 ℃,用時取出融化,在可以密封的玻璃管中加入上述單糖標準品各5 μL,混勻。然后加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL,與樣品同時在120 ℃條件下水解120 min,空氣泵吹干。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)衍生化:向水解干燥后得到的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L的PMP溶液和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL,充分混勻后,水浴70 ℃反應30 min。冷卻至室溫,加入0.3 mol/L HCl溶液0.5 mL,充分混勻。平均分成兩份到EP管中,其中一份備用,在備用樣品中滴入一滴氯仿置于4 ℃冰箱。另外一份加入0.5 mL氯仿,充分振蕩萃取,離心(5 000 r/min,5 min)去除氯仿層,共萃取3 次。水層(不低于0.4 mL)用0.22 μm濾膜過濾后,待上機。
儀器條件:色譜柱:T h e r m o O D S-2 C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液-乙腈82∶18(V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量10 μL;波長:245 nm。
1.3.9 紅外光譜分析
稱取多糖干燥樣品1 mg和KBr混合研磨壓片后在波長范圍為4 000~500 cm-1采用紅外光譜儀掃描分析,觀察吸收峰,對多糖的構型進行初步分析。
本實驗應用Origin 6.0和Excel軟件進行分析作圖,各組實驗均重復3 次,以 ±s表示,響應面試驗設計與分析采用Design-Expert V 8.0.6軟件。
2.1.1 單因素試驗結果

圖1 單因素試驗結果Fig. 1 Results of one-factor-at-a-time experiments
由圖1a可以看出,多糖提取量在料液比為1∶20(g/mL)時達到最大,超過1∶20(g/mL)后,多糖提取量下降,推測是由于增加溶劑,有利于多糖溶出,而溶劑用量過大會影響提取體系的傳熱和傳質,使多糖提取量降低[25];由圖1b可知,多糖提取量隨超聲時間的延長而增加,至50 min時達到最大,之后隨著時間的延長多糖提取量趨于平緩,可能由于超過50 min后,提取時間的延長使雜質溶出增多,多糖提取量增加緩慢[26];多糖提取量隨著超聲功率的增加也逐漸上升,130 W時提取量達到最大,隨后,超聲功率的升高不再增加多糖提取量,反而有所下降(圖1c),這可能是因為超聲功率增加,超聲熱效應變大,使多糖降解,提取量降低[25];由圖1d可以看出,多糖提取量在超聲溫度為50 ℃時達到最大,低于或高于50 ℃時提取量都顯著下降,可能由于溫度過高,溶劑揮發使溶液黏度增大,不利于多糖溶解,從而使多糖提取量下降[26]。所以,在料液比1∶10~1∶30(g/mL)、超聲時間40~60 min、超聲功率120~140 W、超聲溫度40~60 ℃范圍內進行Box-Behnken試驗。
2.1.2 Box-Behnken試驗結果

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with experimental values of polysaccharide yield

表3 Box-Behnken試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for the effect of extraction conditions on polysaccharide yield
對表2梨渣多糖提取量的試驗數據進行多元回歸擬合后,由統計軟件Design-Expert V 8.0.6分析,建立二次多元回歸方程:Y=61.81+0.96A+1.24B+1.50C-0.51D-7.04AB+1.95AC-1.27AD-1.07BC+2.60BD+3.93CD-4.88A2-3.2B2-4.75C2-2.64D2。
從表3可以看出,建立的模型F值為27.63(P<0.000 1),說明該模型極顯著,失擬項P值為0.296 9大于0.05,不顯著,說明該模型可以很好地擬合試驗的真實情況,可以用于梨渣多糖提取工藝的優化。其中R2值為0.965 1,校正后決定系數R2Adj值為0.930 1,說明該模型能夠解釋93.01%試驗數據響應值的變化。此外,AB、CD、A2、B2、C2、D2對多糖的提取量影響差異極顯著,B、C、AC、BD對多糖提取量影響高度顯著,A對多糖提取量影響顯著,D、AD、BC項不顯著(P>0.05),需將此3 項從回歸模型中刪除。因此,回歸模型方程最終為Y=61.81+0.96A+1.24B+1.50C-7.04AB+1.95AC+2.60BD+3.93CD-4.88A2-3.2B2-4.75C2-2.64D2。
2.1.3 交互作用分析


圖2 各因素交互作用對梨渣多糖提取量影響的響應面圖Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the extraction efficiency of polysaccharides
由圖2a可知,多糖提取量分別隨著超聲時間和溶劑用量的增加呈現升高的趨勢之后趨于平緩,兩者的交互作用顯著。由圖2b可知,超聲功率和料液比對多糖提取量的影響均呈拋物線趨勢,即隨超聲功率和溶劑用量的增加,多糖提取量呈先升高后降低的趨勢,兩者交互作用曲面較陡,即對多糖提取量影響顯著。由圖2e可知,多糖提取量隨超聲溫度的升高和時間的延長先升高最后趨于平穩,且多糖提取量隨超聲時間的延長大于超聲溫度的變化,說明超聲時間對多糖提取量的影響較大。由圖2f可知,多糖提取量隨超聲功率的增加先上升后下降,呈現拋物線的趨勢,而隨超聲溫度的升高先上升后趨于平緩,兩因素的交互曲面較陡,說明兩因素的交互作用顯著。
2.1.4 驗證實驗結果
經Design-Expert優化后得到的最優條件為料液比1∶13.26(g/mL)、超聲時間60 min、超聲功率131.99 W、超聲溫度57.08 ℃,此時多糖提取量的理論值最高為62.680 1 mg/g。為驗證最優條件的準確性,考慮到實際操作的可行性,設定最優條件為料液比1∶13(g/mL)、超聲時間60 min、超聲功率132 W、超聲溫度57 ℃,在此條件下進行3 次重復實驗后測得多糖提取量的平均值為62.375 mg/g,與理論值接近,說明該工藝穩定可靠,具有一定的應用價值。
經前期實驗測定,水浴醇沉法在Design-Expert優化后得到的最優條件(料液比1∶35(g/mL)、溫度67 ℃、時間3.7 h)下,測得多糖提取量的最大值為56.879 9 mg/g,低于62.375 mg/g,且超聲輔助提取法具有省時、高效、便于操作等優點,故綜合考慮選取超聲輔助法提取黃梨渣多糖。

圖3 脫蛋白方法對多糖的影響Fig. 3 Effects of deproteinization methods on protein removal and polysaccharide loss
由圖3可以看出,單獨使用Sevag法脫蛋白,可以去除51.16%蛋白質,此方法使用次數多、耗時長、有機試劑用量大、多糖損失率高;單獨使用木瓜蛋白酶法脫蛋白,多糖損失率降低到22.39%的同時可去除56.82%的蛋白質,這是由于木瓜蛋白酶可以起到降解蛋白質的作用;在酶法基礎之上再進行5 次Sevag法脫蛋白后,蛋白脫除率為75%且多糖損失率僅為24.71%。故用酶法和Sevag法聯合除蛋白可達到簡化操作工藝、省時、最大限度去除蛋白質[22]的同時保證多糖得率的目的。因此,該方法是一種去除蛋白較為理想的方法。

圖4 脫色方法對多糖的影響Fig. 4 Effects of decolorization methods on decoloraization rate and polysaccharide loss
由圖4可以看出,H2O2法脫色率最高,可達78.56%,且多糖損失率最低,僅25.86%。由于活性炭對色素吸附具有特異性,所以活性炭脫色率較低,多糖損失率高達54.35%,用反膠束溶液法脫色時,脫色率僅47.69%且多糖損失率較高。H2O2法脫色通過氧化色素來達到脫色目的,脫色效果好,操作簡單,能最大限度地降低多糖損失率[14],因此,選用H2O2法對多糖進行脫色。
用苯酚-硫酸法測定90 管樣品溶液的多糖含量,以試管數目為橫坐標,以吸光度為縱坐標作洗脫曲線圖。從圖5可以看出,脫蛋白、脫色、透析后的梨渣多糖經DEAE-52纖維素柱層析分離得到3 個峰,表明梨渣多糖由3 種不同組分構成,分別為LPB-A、LPB-B和LPB-C,結果如圖5所示,第23~32管為LPB-A,第33~38管為LPB-B,第50~60管為LPB-C,三組分峰形對稱較好,說明以0~1 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液進行線性洗脫能較好地分離梨渣多糖。經DEAE-52柱分離后LPB-A、LPB-B含量較少,故后續實驗僅對LPB-C進行繼續研究。

圖5 多糖DEAE-52纖維素柱洗脫曲線Fig. 5 Elution profile of polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography
2.5.1 Sephadex G-100凝膠柱層析

圖6 LPB-C的Sephadex G-100凝膠柱洗脫曲線Fig. 6 Elution profile of LPB-C on Sephadex G-100 column
如圖6所示,多糖LPB-C經過Sephadex G-100凝膠柱流出的曲線呈單一對稱峰,說明經過一系列處理后多糖LPB-C已經被純化,且為相對分子質量分布均一的組分,是一種較純的多糖。
2.5.2 紫外吸收光譜結果

圖7 梨渣多糖LPB-C的紫外掃描圖Fig. 7 UV absorption spectrum of LPB-C
如圖7所示,多糖的特征吸收峰出現在225 nm波長處,260 nm和280 nm波長處沒有出現吸收峰,表明經DEAE-52纖維素柱層析純化后的多糖不含核酸和蛋白質等雜質,說明LPB-C是一種較純的多糖。
2.5.3 凍融實驗結果
LPB-C經凍融離心后沒有沉淀出現,表明LPB-C為一種較純的多糖。
綜上可知,3 種方法都證明LPB-C為相對分子質量分布單一的組分,是一種較純的多糖。

圖8 梨渣精多糖LPB-C的ηsp/c-c圖Fig. 8 ηsp/c versus c plot of LPB-C
多糖分子的不均一性導致其分子質量的測定比較困難,通常所測得的分子質量是一種統計平均值,只代表一定分子質量范圍的平均分布而不是確切大小。本實驗測定經分離純化后分子質量分布比較均一的梨渣多糖LPB-C組分的相對分子質量。如圖8所示,經測定,其特性黏度[η]為1.11 cm3/g,已知在25 ℃時,K值為2×10-4,α值為0.76,根據Mark-Houwink公式可求得梨渣多糖LPB-C的黏均分子質量為8.47×104g/mol。

圖9 混合標準單糖衍生物的超高效液相色譜圖Fig. 9 UPLC chromatogram of derivatives of standard monosaccharide mixture

圖10 黃梨渣多糖衍生物的超高效液相色譜圖Fig. 10 UPLC chromatogram of derivatives of LPB-C
將黃梨渣多糖衍生物的超高效液相色譜圖與混合標準單糖進行對比(圖9和圖10)可知,7~12 min的色譜峰為PMP溶劑峰,根據其出峰時間可以確定黃梨渣多糖中含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和木糖,根據峰面積計算出4 種單糖的物質的量比為3.3∶2.3∶10.6∶23.2。

圖11 LPB-C的紅外光譜圖Fig. 11 IR spectrum of LPB-C
由圖11可知,LPB-C具有多糖的特征吸收峰:3 376.54、3 234.76 cm-1處為氫鍵的—OH伸縮振動吸收峰,說明存在分子內或分子間氫鍵;2 979.18 cm-1處為糖類的C—H伸縮振動吸收峰;1 629.92、1 552.76 cm-1處為C=O伸縮振動吸收峰;1 464.03 cm-1處的吸收峰為CH3、CH2、CH等的C—H面內彎曲振動;1 400、1 297 cm-1為—COOH中C—O伸縮振動,說明存在糖醛酸結構;1 135 cm-1為多糖中糖的醚鍵C—O—C伸縮振動吸收峰;1 040 cm-1處為吡喃環的變形振動,說明該多糖可能為吡喃型多糖;908 cm-1處為β-D-吡喃葡萄糖的特征吸收峰,說明此多糖級分中含有β糖苷鍵;經比對,663、595 cm-1處可能為鼠李糖的特征吸收峰[18],說明LPB-C中含有鼠李糖。
本實驗研究黃梨渣中多糖的提取、分離純化的方法,并對其相對分子質量、單糖組成以及基本結構進行分析。最終確定采用超聲波輔助提取法提取梨渣多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶13(g/mL)、超聲時間60 min、超聲功率132 W、超聲溫度57 ℃,多糖提取量可達到62.38 mg/g,比水浴醇沉法的提取量(56.9 mg/g)高,且大大節省了時間[27-28]。Sevag法與酶法聯合除蛋白的方法效果最佳,蛋白脫除率和多糖損失率分別為75%和24.71%,此法簡化了操作工藝,省時,最大限度去除蛋白質的同時可保證多糖得率。H2O2法脫色率最高,可達78.56%,且多糖損失率最低,僅25.86%。脫蛋白、脫色、透析后的梨渣多糖經DEAE-52纖維素柱層析分離得到LPB-A、LPB-B和LPB-C三個不同的組分,其中LPB-A、LPB-B含量較少,故僅對LPB-C進行結構鑒定。對于同一種物質,不同方法測定出的相對分子質量也有所差別,經烏氏黏度計法測定,LPB-C的黏均分子質量約為8.47×104g/mol。用高效液相色譜法[29-31]測得黃梨渣多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和木糖組成,且物質的量比為3.3∶2.3∶10.6∶23.2,經紅外光譜法分析進一步得出其是一種含有β糖苷鍵的吡喃型多糖,這為高平黃梨進一步研究和綜合開發利用提供了一定參考價值。