高效紫云英根瘤菌的選育

李晶　蔡少麗　林金新

摘 要 通過分離鑒定、回接及盆栽試驗，篩選出能高效結瘤、具有高效固氮酶活性，能有效提高紫云英生物量的紫云英根瘤菌作為目標菌株，制備液體菌劑應用于田間試驗并測定其效果。結果表明，本試驗篩選出的3株目標菌株均發揮了根瘤菌優越的生物固氮作用，增加了根瘤菌數量，提高了紫云英的生物學產量，并以GL-L-6菌株表現為最優。

關鍵詞 根瘤菌；紫云英；生物固氮

中圖分類號：S154 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.18.102

我國耕地面積占全球的7%，而年消耗氮肥占世界的30%，氮肥利用率僅10%～30%。人工施用化學氮肥流失率往往大于50%，多余的氮素會導致土壤酸化，破壞土壤和微生物原先的氮循環能力，因此微生物的生物固氮作用對于改善植物氮素營養、降低化肥的使用、減少環境污染、并保持可持續發展具有重要的意義[1]。豆科植物-根瘤菌共生體系的固氮功能發揮了極大的作用，全球每年生物固氮量約2.0億噸，豆科植物-根瘤菌的共生固氮體系占了65%～80%；為共生的豆科植物提供所需氮肥的50%～100%，因此豆科植物-根瘤菌間的共生固氮是自然界植物氮素最經濟、最有效的來源[2]。

紫云英是一種綠肥作物，富含有機質，有利于改良土壤、培肥地力、減少化肥用量，并改善農田生態環境，提高農產品產量和品質，降低農業生產成本。用冬閑田地種植紫云英是充分利用冬季溫光資源解決耕地冬季閑置的有效途徑。紫云英一直是我國南方各省稻田主要綠肥肥源之一，種植面積較大，紫云英與優良的根瘤菌菌株拌種使用可以大幅度提高紫云英畝產量。我國南方廣大地區長期以來就通過種植紫云英作物綠肥改善土壤理化狀況，提高土壤氮素營養，因此，大力發展紫云英種植對南方地區的農業生產具有重要的意義[3-4]。

根瘤菌具有較強的宿主專一性，其共生固氮過程需要有合適的宿主，同時由于其屬于革蘭陰性菌，其環境生存能力低于芽孢桿菌，因此在紫云英根瘤菌的應用推廣中，菌種的選育改良、優化發酵工藝、采用合適的保存方法提高其存活率，對其應用至關重要[5]。

1 材料與方法

1.1 根瘤的采集與根瘤菌分離鑒定

從生長狀況良好的紫云英植株根部選擇肥大、飽滿、粉紅色的根瘤，用水沖洗干凈，再用無菌水沖洗，濾紙吸干后，用75%乙醇浸泡2 min、0.1%氯化汞浸泡2～5 min，無菌水沖洗5～6次后，在無菌條件下，用鑷子將根瘤壓碎。將擠出液接種至選擇性平板上，28 ℃培養，挑取長出的單菌落，再次進行劃線，分離后獲得的單菌落移至斜面上保存，并進行革蘭染色和形態學鑒定，此為獲得初步分離的根瘤菌菌株[6]。

1.2 根瘤菌回接試驗

將分離到的紫云英根瘤菌培養后接種到經催芽的紫云英種子上，在無氮培養液中培養，同時以不接種的紫云英作為對照。待接種處理后的紫云英結瘤，根據根瘤的大小、瘤重、有效瘤數量等指標判斷根瘤菌菌種的優劣。將保存結瘤能力較好的根瘤菌作為備選的菌株。

1.3 盆栽試驗

進一步進行盆栽試驗，對根瘤菌菌株進行篩選。選擇大小相近的紫云英種子，播種在盛有滅菌蛭石的塑料盆（15 cm×13 cm）中，每盆5顆種子，分別接種供試根瘤菌懸液1 mL，以不接種為對照，每個處理設3個重復。將植株置于白天28～30 ℃、夜間15～20 ℃、每天光照8 h的溫室中培養，依據結瘤情況及紫云英生長性狀選擇比較優良的根瘤菌菌株。隨后以土培法對第二輪篩選得到的根瘤菌菌株進行進一步篩選，選擇在多個紫云英品種上都能高效結瘤，并能有效提高紫云英生物量的根瘤菌為目標菌株。

1.4 固氮酶活測定

紫云英的根瘤較小，為避免根瘤離體后影響真實酶活性，取紫云英完整根系置于10mL的小瓶子內，采用乙炔還原法測定固氮酶活性，重復3次。

1.5 田間試驗

將篩選得到的菌種在YMA培養基中擴大培養，得到紫云英根瘤菌液體菌劑，平板計數測定活菌數與雜菌率。按每1 kg紫云英種子加75 mL根瘤菌的比例拌種晾干后馬上播種。收獲時，觀察結瘤比例、數量、飽滿度、顏色等，測定紫云英產量增加情況。

1.6 植株總氮含量測定

植株含氮量測定按照農業行業標準《有機肥料》（NY 525-2012）中總氮含量測定方法進行[8]。

2 結果與分析

2.1 分離純化獲得的根瘤菌

選取肥大、飽滿、粉紅色的有效紫云英根瘤15個，利用平板分區劃線法分離獲得單菌落11個，分別命名為GL-L-1、GL-L-2、GL-L-3、GL-L-4、GL-L-5、GL-L-6、GL-L-7、GL-L-8、GL-L-9、GL-L-10和GL-L-11。革蘭染色鏡檢均為大小一致的革蘭陰性桿菌。經28 ℃培養3 d，出現肉眼可見單菌落，直徑2～8 mm，水泡狀、透明水潤，生長旺盛時可見流動膠質，具備一般根瘤菌形態特征。

2.2 根瘤菌回接及盆栽試驗結果

將初步分離到的11株紫云英根瘤菌進行回接及盆栽試驗，計數結瘤情況，計量根瘤鮮重、株鮮重、株干重，結果見表1。如表1所示，結果表明接種選育的根瘤菌對紫云英結瘤及長勢上都有明顯的促進作用。未接種根瘤菌的植株沒有結瘤，接種根瘤菌的紫云英植株均明顯結瘤，結瘤數在15.1～26.2個/株；在植株鮮重上，接種根瘤菌的全部實現增產，增幅73.91%～141.24%；其中菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9在結瘤數目及鮮重增重上較其他株更有上佳表現，故確定為目標菌株，后續試驗將圍繞這3個菌株開展研究。

2.3 固氮酶活性測定結果

判斷是否具有固氮作用，必須進行固氮酶活性檢測。采用乙炔還原法測定根瘤還原乙炔為乙烯的濃度從而間接測定菌株是否有固氮酶活性及其高低。目標菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9固氮酶活性測定結果如表2所示，3株菌株均有固氮酶活性，并綜上試驗結果，其中GL-L-6固氮酶活性最強，植株產量也最高。

2.4 田間效果試驗

將3株目標菌株分別制得的紫云英根瘤菌液體菌劑經田間試驗，收獲時觀察，可見結瘤數量多，根瘤飽滿，均以粉紅色有效根瘤為主。測定植株鮮重反映紫云英產量，并以未添加根瘤菌液培養的紫云英植株鮮重作為對照，其植株鮮重和計算得出的增幅見表3，分別經GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌種播種培養后，紫云英產量增幅明顯，達91.5%以上，并以GL-L-6菌液拌種培養紫云英產量增幅最大，達121.88%。

2.5 植株總氮含量測定結果

測定3株目標菌株的總氮含量，記錄于表4中。如表所示，經GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌種培養后對提高紫云英植株的含氮量有明顯效果，增幅達68.66%以上，并以GL-L-6增幅最大，達82.59%。

3 討論

比較了不同紫云英根瘤菌對紫云英的結瘤性、固氮酶活性、含氮量及提高紫云英產量的作用。試驗結果肯定了GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌株較其他8株根瘤菌優越，在紫云英上接種選定的這3株目標根瘤菌劑，均發揮了根瘤菌的生物固氮作用，增加了根瘤菌數量，提高了紫云英的生物學產量，并以GL-L-6菌株表現為最優。選育出優良性狀的根瘤菌菌株，制備微生物肥料應用于農業生產中，對改善土壤結構、提高土壤氮素營養、保護土壤生態環境具有重要的意義。

優化發酵條件，研究根瘤菌劑作為微生物肥料在土壤中的競爭狀況和存活時間，探究影響微生物肥料發揮作用的因素等問題，在與促進豆科植物結瘤固氮方面的功能進行更細致的研究，才能為微生物肥料應用于生產實踐奠定更為堅實的理論基礎。同時，加快成果轉化，加強高校、科研院所與企業的合作步伐，并切實加大推廣面積和創新力度，才能為全面實現農業生產可持續發展起到積極的推進作用[9]。

參考文獻：

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[3] 陳海榮，郭照輝.紫云英根瘤菌培養基的選擇與優化[J].湖南農業科學，2011，41（1）：13-15.

[4] 朱旭娟.旌德縣紫云英接種根瘤菌劑種植試驗[J].安徽農學通報，2013，19（14）：79.

[5] 龍則軍.紫云英應用根瘤菌劑種植技術大田展示[J].現代農業科技，2017，46（15）：178-184.

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[7] 劉麗，馬鳴超，姜昕，等.根瘤菌與促生菌雙接種對大豆生長和土壤酶活的影響[J].植物營養與肥料學報，2015，21（3）：644-654.

[8] 張曉榮，于仁宗.有機肥料總氮含量測定過程應注意的問題[J].南方農業，2014，8（27）：177-178.

[9] 許景鋼，孫濤.我國微生物肥料的研發及其在農業生產中的應用[J].作物雜志，2016，32（1）：1-6.

（責任編輯：劉昀）