Box-Behnken響應面法優化孔石莼多糖絡合鋅工藝

湯陳鵬，呂 峰，王蓉琳

(福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

鋅是人體必需的微量元素之一，其在人體的生理活動中起著重要的作用。缺鋅會導致食欲不振、免疫力降低、兒童發育遲緩等癥狀，還容易誘發冠心病、高血壓、高血糖等疾病[1]，同時男性生殖系統疾病與缺鋅也有著密切的關系[2]。無機補鋅劑，例如硫酸鋅、氧化鋅等，在使用時人體吸收率較低，且對胃腸道刺激較大[3]。文獻資料表明，與無機鋅相比，有機鋅在人體的利用率和生理活性方面有著顯著的優勢[4-6]。

孔石莼是我國的一種大型經濟綠藻，屬于綠藻門石莼科石莼屬，多分布于北太平洋的西部、朝鮮、日本以及中國沿海[7]?？资恢泻胸S富的營養與活性成分，如多糖、氨基酸、蛋白質、維生素等[8]，特別是孔石莼多糖含量豐富。大量研究證明，孔石莼多糖具有諸多的生物活性，如降血糖[9]、降血脂[10]、抗腫瘤[11]、抗氧化、抗輻射[12]等，開發前景廣闊。

多糖的絡合改性指的是多糖與金屬或某些非金屬離子發生絡合反應，生成絡合物的改性方法。許多研究表明，多糖的絡合改性不僅能顯著提高其本身的生物活性，甚至還可賦予新的功能；此外，經過絡合的金屬更容易被生物體所吸收。絡合改性已然成為多糖改性領域中頗受重視的一類改性方法。通過絡合改性將孔石莼多糖與鋅結合，可以獲得一種兼具多糖生理活性的有機補鋅劑，具有廣闊的研究和應用前景，可為孔石莼資源的高值化利用和新型生物補鋅劑的開發提供理論依據，而目前尚未有研究對此進行探索。

本研究以孔石莼脫蛋白多糖為原料，采用硫酸鋅與其進行絡合反應，制備了孔石莼多糖鋅絡合物，并采用3因素3水平的Box-Behnken響應面法對其絡合鋅工藝進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔石莼粉末：80目，購于福建海興保健食品有限公司。

硫酸鋅、95%乙醇、檸檬酸、鹽酸、碳酸鈉，均為分析純；鹽酸，食品級；硝酸、高氯酸，均為優級純；1 000 mg/L鋅標準溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；纖維素酶(200 000 U/g)：寧夏和氏璧生物技術有限公司；堿性蛋白酶(200 000 U/g)：江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

BSA223S分析天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；SK8210LHC型超聲清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；RE52-99型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；DL-5-B離心機：上海安亭科學儀器廠；PHB-3 pH計：上海三信儀表廠；FreeZone 6L落地式凍干機：美國LABCONCO公司；AA-6300C原子吸收分光光度計：日本島津儀器設備公司。

1.3 試驗內容與方法

1.3.1 孔石莼脫蛋白多糖的制備

孔石莼粉末→以料液比1∶30(g/mL)加蒸餾水→使用檸檬酸調節pH=4.8→按每g孔石莼粉末加入400 U已活化的纖維素酶→ 45℃超聲提取90 min→煮沸滅酶10 min→200目絹布過濾→ 4 000 rpm離心10 min→收集上清液→真空濃縮→冷藏醇沉過夜→離心、收集固體→加水溶解→真空濃縮→冷凍干燥→孔石莼多糖粗品。

孔石莼多糖粗品→料液比1∶100(g/mL)加蒸餾水→使用碳酸鈉調節pH=10.5→按每g孔石莼多糖粗品加入1 400 U已活化的堿性蛋白酶→55℃酶解2.0 h→煮沸滅酶10 min→4 000 rpm離心10 min→收集上清液→調pH至中性→ 7 000 Da透析袋透析36～48 h→真空濃縮→冷凍干燥→孔石莼脫蛋白多糖(多糖含量53%)。

1.3.2 孔石莼多糖絡合鋅工藝流程

孔石莼脫蛋白多糖→配制成一定濃度的溶液→按既定質量比加入硫酸鋅溶液→調節pH→恒溫水浴反應90 min→反應液透析除去未發生絡合反應的Zn2+→真空濃縮→冷凍干燥→孔石莼多糖鋅絡合物。

1.3.3 Box-Behnken響應面法優化孔石莼多糖絡合鋅工藝

基于前期探索性試驗，設反應體系的Zn2+濃度3.00 mg/mL、反應時間90 min，以反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)為自變量，孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量(Y)為響應值，采用3因素3水平的Box-Behnken響應面法優化孔石莼多糖絡合鋅工藝。3因素3水平的Box-Behnken響應面試驗設計的因素水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken響應面因素水平編碼表

1.4 指標檢測與方法

1.4.1 Zn2+標準曲線制作

依照國標GB 5009.14—2017 《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[13]的方法，準確吸取鋅標準儲備液(1000 mg/L)1.00 mL于100 mL容量瓶中，加入3.3%硝酸溶液定容，混勻，配成10 mg/L的鋅標準中間液。分別準確吸取鋅標準中間液 0.00、1.00、2.00、4.00、 8.00和10.00于100 mL容量瓶中，加入3.3%硝酸溶液定容，混勻，制備成質量濃度分別為 0.000、0.100、0.200、0.400、0.800和1.000 mg/L的系列鋅標準溶液，在火焰原子吸收分光光度計中測定其吸光度，得到Zn2+標準曲線。

1.4.2 孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量的測定

參照國標GB 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[13]，稱取孔石莼多糖鋅絡合物0.1 g放入消解罐中，加入濃硝酸、高氯酸進行消解，消解產物稀釋定容，測定吸光度，帶入回歸方程(1)計算Zn2+濃度，鋅含量Q計算公式如下：

Q=cVD/1 000m

(1)

式中：Q為鋅含量(mg/g)；c為待測液Zn2+濃度(μg/mL)；V為消解產物定容體積(mL)；D為稀釋倍數；m為孔石莼多糖鋅絡合物質量(g)。

2 結果與分析

2.1 Zn2+標準曲線的建立

Zn2+的回歸方程為：

y=0.470 02x+0.028 690，R2=0.999 6

(2)

式中：x為待測液Zn2+濃度(μg/mL)；y為吸光度。

2.2 回歸方程的建立與方差分析

采用 Design Expert 8.0.5統計分析軟件對表2數據進行處理，建立反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)3個因素與響應值孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量(Y)的回歸方程為：

Y=101.72+0.76X1-0.83X2-1.72X3-1.32X1X2-0.43X1X3+1.18X2X3-3.28X12-3.49X22-6.33X32

(3)

為驗證回歸方程(3)的有效性，對其進行方差分析，結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果(n=3)

表3 孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量方差分析表

注：*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01)。

Notes：*indicated significant difference(P<0.05)；**indicated extremely significant difference(P<0.01).

2.3 單因素對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響效應分析

對回歸方程(3)進行降維分析，將反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)三因素的其中兩個因素固定為零水平，考察各單因素在不同水平上對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量(Y)的影響，并得到以其中一個因素為決策變量的偏子回歸模型，使用Excel軟件繪圖得到各因素對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量(Y)影響的曲線，結果見圖1。

結合圖1與表3可知，三因素對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量Y影響的顯著性大小依次為孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)>反應體系pH值(X2)>反應溫度(X1)。固定其他兩個因素為零水平時，鋅含量(Y)均隨各因素水平的提高先增加后減少。當反應溫度X1水平為0.12(即50.60℃)，反應體系pH值X2水平為-0.12(即4.94)，而孔石莼多糖與Zn2+質量比X3水平為-0.14(即2.86∶1)時，孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量均可分別達到最大值，依次分別為101.76 mg/g、101.77 mg/g、101.84 mg/g。

2.4 試驗因素間交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響效應分析

根據表3的方差分析結果可知，試驗因素間交互項對孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量Y有顯著影響(P<0.05)的是X2X3(即反應體系pH值和孔石莼多糖與Zn2+質量比)，有極顯著(P<0.01)影響的是X1X2(即反應溫度與反應體系pH值)，本研究即對此二項進行分析，結果見圖2、圖3、表3。

2.4.1 反應溫度與反應體系pH的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響

圖2中(a)等高線呈橢圓形，說明反應溫度X1與反應體系pHX2的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量有極顯著影響(P<0.01)；從圖2(b)響應面圖可以看出，當孔石莼多糖與Zn2+質量比X3固定為零水平(即3∶1)時，反應溫度X1在45.0～50.7℃范圍內，反應體系pHX2在4.50～4.93范圍內，兩因素的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量Y的影響呈正相關關系，即鋅含量Y隨兩因素水平上升而增加；而當反應溫度X1>50.7℃、反應體系pHX2>4.93的范圍內，兩因素的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量Y的影響呈負相關關系，即鋅含量隨兩因素水平上升而呈下降趨勢。從圖2(a)中還可看出，反應體系pHX2軸向等高線分布較密集，說明在本研究的絡合反應過程中，反應體系pHX2對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響較反應溫度X1顯著。

反應溫度的適度上升可以加劇體系中反應分子的運動，促進孔石莼多糖與Zn2+的絡合，而反應體系pH的適當提高可以降低體系中H+的濃度，減小其與金屬離子競爭絡合的程度[14]，從而提高產物的鋅含量，因此在一定范圍內，當反應溫度和反應體系pH同時上升時，兩者效應的疊加可以大幅度提高孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量；但是由于絡合反應本身是一個放熱反應，若溫度過高時，Zn2+運動過快，與多糖的絡合會變得困難，且已形成的絡合物穩定性也會減弱[15]； 而pH過高時，反應體系中游離的Zn2+容易生成Zn(OH)2，導致游離Zn2+濃度明顯降低，亦影響絡合效果。綜上，若當二因素水平均偏低或過高時，兩者的交互作用均不利于孔石莼多糖對Zn2+的絡合作用。

2.4.2 反應體系pH和孔石莼多糖與Zn2+質量比的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響

結合表3與圖3(a)可知，反應體系pHX2和孔石莼多糖與Zn2+質量比X3的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響顯著(P<0.05)，且孔石莼多糖與Zn2+質量比X3對鋅含量的影響較反應體系pHX2顯著。圖3(b)顯示，當反應溫度X1固定為零水平(50℃)時，反應體系pHX2在4.50～4.93范圍內，孔石莼多糖與Zn2+質量比X3在2.0∶1～2.8∶1范圍內，二者的交互作用對鋅含量Y的影響呈正相關關系；而當反應體系pHX2>4.93、孔石莼多糖與Zn2+質量比>2.8∶1的范圍內，二者的的交互作用對鋅含量Y的影響呈負相關關系。

多糖與金屬離子質量比的適當增加，不僅促進二者的絡合，提高反應進行程度，還可以提高絡合物的穩定性[16]；而反應體系pH的適當提高可以降低體系中H+與金屬離子競爭絡合多糖，以確保多糖對金屬離子的絡合，因此在一定范圍內，當反應體系pH和孔石莼多糖與Zn2+質量比同時上升時，兩者作用的協同效應極大地提高了產物的鋅含量。反之，若反應體系pH過高，且孔石莼多糖與Zn2+的質量比過大時，一方面反應體系的Zn2+容易生成Zn(OH)2，使體系中游離Zn2+濃度大幅降低，另一方面孔石莼多糖含量過高，反應體系的粘度變大，阻礙分子運動，兩種作用均可明顯影響絡合效果。綜上，當兩因素值均過高時，兩者的交互作用將顯著地降低孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量。

2.5 工藝優化與驗證試驗

使用Design Expert 8.0.5對回歸方程(3)求解，計算得出孔石莼多糖絡合Zn2+的最佳工藝條件組合為反應溫度50.8℃、pH 4.91、孔石莼多糖與Zn2+質量比2.8∶1，得到孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的預測值為101.99 mg/g(注：該預測值略低于響應面試驗中若干組實際值，其可能是試驗誤差所致)。為提高實際操作的便利性，將試驗條件校正為反應溫度50℃、pH 5.0、孔石莼多糖與Zn2+質量比2.8∶1，同時控制反應體系中的Zn2+濃度為3.00 mg/mL、反應時間90 min，進行擴大性驗證試驗，平行重復3次，所得孔石莼多糖鋅絡合物中鋅含量為(102.41±0.67)mg/g，與理論預測值(101.99 mg/g)相對誤差為0.41%，沒有顯著性差異，說明預測值與實際值擬合性較好，響應面得到的絡合工藝參數準確可靠，在實際生產中可行。

3 結論

本研究基于前期探索性試驗，在控制反應體系中的Zn2+濃度為3.00 mg/mL、反應時間90 min的前提下，采用Box-Behnken響應面試驗設計優化孔石莼多糖絡合鋅反應的主要工藝參數，建立了反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)3個因素與響應值孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量(Y)的回歸方程為：

Y=101.72+0.76X1-0.83X2-1.72X3-1.32X1X2-0.43X1X3+1.18X2X3-3.28X12-3.49X22-6.33X32

通過對回歸方程的方差分析可知，孔石莼多糖與Zn2+的質量比、反應溫度與反應體系pH的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響極顯著(P<0.01)；反應溫度、反應體系pH和孔石莼多糖與Zn2+質量比的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響顯著(P<0.05)。經過計算和校正，獲得孔石莼多糖絡合鋅的最佳工藝參數組合為孔石莼多糖與Zn2+質量比2.8∶1、反應溫度50℃、反應體系pH 5.0，以此條件下進行絡合的效果理想，孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量為(102.41±0.67)mg/g，與預測值101.99 mg/g之間的差異不顯著(P>0.05)。

綜上說明，該響應面模型與實際數據擬合性較好，可以很好地適用于孔石莼多糖絡合鋅工藝的優化。