組蛋白去乙酰化酶4在異氟烷預處理抑制脂多糖誘導的炎癥反應中的作用

郭欣瑩 鄭彬 阮祥才

廣州醫科大學附屬市第一人民醫院麻醉科（廣州 510180）

異氟烷，作為臨床上廣泛使用的吸入麻醉藥物，具有免疫調節作用。有研究［1-2］表明，異氟烷可以降低中性粒細胞的活性，抑制巨噬細胞釋放細胞因子［3］，減弱自然殺傷細胞對干擾素的反應［3-4］等。異氟烷預處理，是一種與缺血預處理（ischemic preconditioning，IPC）類似的現象，具有抗炎和保護缺血/再灌注損傷效應［5］。在圍手術期，由麻醉、手術等刺激而引起的炎癥反應是常見的臨床現象。研究［4］發現，在脂多糖誘導炎癥反應，異氟烷預處理能降低單核?巨噬細胞釋放炎癥因子，并有效改善急性呼吸窘迫綜合征和急性肺損傷大鼠的癥狀［6-7］。然而，異氟烷預處理對機體炎癥反應的調節機制仍不明確。

近年來研究［8］表明，疾病的發生、發展、環境因素（如飲食習慣、藥物、吸煙）都能引起表觀遺傳學機制的改變。而異氟烷等吸入麻醉藥的免疫調節作用與表觀遺傳學修飾之間具有密切的關系。其中，異氟烷可對組蛋白的乙酰化修飾和組蛋白去乙酰化酶產生不同程度的影響，進而影響其對靶基因的轉錄過程，最終造成神經炎癥或認知功能發育障礙［9-11］。有相關研究［12-13］表明，HDAC4在組蛋白乙酰化修飾調控炎癥反應的發生、發展過程中起重要調控作用。在血管平滑肌細胞中，TNF?α能促進HDAC4核轉位，激活ROS介導NF?κB信號通路，從而調節血管炎癥。而利用siRNA技術在血管平滑肌細胞內干擾HDAC4的表達，能抑制TNF?α介導的單核細胞粘附、VCAM?1表達、NF?κB信號通路和ROS的產生，從而抑制高血壓的發生和發展［13］。因此筆者推測HDAC4可能是異氟烷預處理調節炎癥反應過程中的重要靶點之一。

本研究擬觀察內毒素刺激對人單核細胞HDAC4核轉位的影響，以及異氟烷預處理的相應效果，將有助于明確異氟烷預處理抗炎和HDAC4核轉位的關系和初步機制，為圍手術期吸入麻醉藥的合理使用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 THP?1細胞購自美國模式培養物集存庫（ATCC）。RPMI1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司。異氟烷（ISO）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。核漿蛋白提取試劑盒購自美國Thermo公司。MTS法細胞增殖與毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司。人TNF?α Quantikine ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。兔抗人HDAC4抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 THP?1細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養。按需要把處于對數生長期的細胞接種到不同體積的培養皿中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 細胞分組 把處于對數生長期的THP?1細胞隨機分為不同的處理組。將THP?1細胞放置于自制的密封的吸入麻醉藥設備中進行預處理。異氟烷預處理組的氣體條件設置為異氟烷1.5%、5%CO2、21%O2、其余用N2的混合氣體填充。對照組使用含有 5%CO2、21%O2、74%N2的混合氣體進行處理。根據相應組別設置異氟烷預處理時間。之后在相應組別中加入脂多糖（400 ng/mL）并置于37℃、含5%CO2的細胞培養箱中處理18 h。

1.2.3 ELISA檢測細胞上清TNF?α的變化 將處理后的THP?1細胞用3 000 r/min，4℃離心15 min后提取上清。采用ELISA試劑盒檢測細胞上清中TNF?α的變化。首先根據說明書方法配置不同濃度的標準品制作標準曲線，然后根據測定的OD值算出相應的TNF?α濃度。

1.2.4 Western blot檢測蛋白的表達 根據核漿蛋白提取試劑盒說明書，分別提取細胞的核蛋白和胞漿蛋白。采用Western blot檢測HDAC4的表達。BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品分別設置相關參數進行電泳和轉膜實驗。轉膜后的PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h。將一抗稀釋成一定的濃度（1∶1 000），并加入PVDF膜上，4℃搖床過夜。第二天用相應二抗（1∶5 000），在室溫孵育1 h。用ECL顯影液進行顯影。用ImageJ軟件計算目的條帶的灰度值進行統計分析。

1.2.5 MTS檢測細胞活力的改變 取100 μL已處理和未處理的THP?1細胞培養液到96孔板中，再在每個孔中加入20 μL MTS試劑。置于37℃、含5%CO2培養箱中孵化2 h。取出后用562 nm比色，記錄所測樣品的吸光值。分別取得已處理和未作處理的細胞的吸光度作比值。

1.2.6 統計學方法 采用GraphPad Prism7對結果進行統計學分析，數據以均數±標準差表示，多組之間總體均數比較使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的脂多糖對TNF?α的釋放和細胞活力的影響 脂多糖濃度為400 ng/mL時，細胞上清中TNF?α的濃度達到最高（P＜0.01）（圖1A）。同時，結果顯示脂多糖濃度為1 500 ng/mL時，細胞活力明顯降低（P＞0.05）（圖1B）。因此，筆者選取脂多糖濃度為400 ng/mL作為后續實驗的劑量。

圖1 各組細胞中TNF?α釋放和細胞活力的變化Fig.1 The releaes of TNF?α and cell viability in each group

2.2 不同的異氟烷預處理時間對脂多糖誘導的TNF?α的釋放和細胞活力的影響 與0 min的異氟烷預處理相比，6和12 h的異氟烷預處理能有效抑制TNF?α的釋放（P＜0.01）（圖2A）。12 h的異氟烷預處理后再加入脂多糖（400 ng/mL）刺激THP?1細胞18 h，細胞活力明顯降低（P＜0.05）（圖2B）。因此筆者選取6 h的異氟烷（1.5%）預處理作為后續實驗的處理時間。

2.3 異氟烷預處理能抑制脂多糖誘導的炎癥因子釋放 與對照組相比，LPS組能明顯促進細胞分泌炎癥因子，TNF?α 的表達增加2.31倍（P＜0.01）。與LPS組相比，ISO+LPS組內THP?1細胞釋放的TNF?α出現一定程度的降低（P＜ 0.05）（圖3）。

圖2 各組細胞中TNF?α釋放和細胞活力的變化Fig.2 The releaes of TNF?α and cell viability in each group

圖3 各組細胞中TNF?α釋放和細胞活力的變化Fig.3 The releaes of TNF?α and cell viability in each group

2.4 異氟烷預處理能抑制脂多糖誘導HDAC4核轉位 與對照組相比，LPS組的核蛋白內HDAC4明顯增加（P＜0.01），但胞漿蛋白的HDAC4降低（P＜0.05）；而ISO組的胞漿蛋白較對照組中HDAC4表達增高。LPS+ISO組的核蛋白較LPS組內HDAC4表達顯著降低（P＜0.01），胞漿蛋白的HDAC4增加（P＜ 0.05）（圖4）。

圖4 各組細胞中HDAC4表達變化Fig.4 The expression of HDAC4 in each group

3 討論

異氟烷作為目前臨床上被廣泛使用的吸入麻醉藥之一，在全身麻醉的誘導及維持過程中占據主導地位。有研究表明異氟烷預處理能抑制脂多糖誘導的炎癥因子的釋放。CHUNG等［14］發現，異氟烷預處理對脂多糖誘導的急性肺損傷起保護作用，它可以通過抑制NF?κB信號通路的激活，從而減少炎癥因子TNF?α，IL?6和IL?1β的釋放。我們的研究結果發現，在脂多糖誘導的炎癥反應中，1.5%異氟烷預處理6 h能有效抑制炎癥因子的釋放。這些結果表明，異氟烷預處理確實具有抑制炎癥因子釋放的能力。因此，在圍手術期，嚴重外傷、重大手術創傷、休克、感染后的病人使用異氟烷預處理可能具有潛在的臨床意義。

炎癥反應屬于臨床上常見的一個病理生理過程，有多種機制參與，現有廣泛研究證實染色質介導的表觀遺傳調節在其中發揮較為關鍵的作用［15］。其中組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學中一種常見形式，它主要由HATs和HDACs共同調節。而特定的組蛋白去乙酰化酶（HDACs）能與不同的信號通路相互作用并調節其生物活性。在糖尿病腎病大鼠模型中，WANG的團隊［15］分別檢測了HDAC1?11在腎臟中的表達，發現HDAC4和HDAC5在腎臟中表達明顯增高，而其中HDAC4與NF?κB信號通路的激活有密切關系，并且發現丙戊酸能通過抑制HDAC4的表達，從而抑制組蛋白H3和H4的乙酰化，導致TNF?α等炎癥因子減少起抗炎作用，從而對腎臟起保護作用［15-16］。值得注意的是，IIa類HDACs包括HDAC4、HDAC5和HDAC7，其中HDAC4在巨噬細胞中高度表達［17］。因此，筆者猜測HDAC4在異氟烷預處理抑制炎癥因子的過程中起重要作用。筆者分別提取THP?1細胞的核蛋白、胞漿蛋白和總蛋白檢測HDAC4的表達，發現：在脂多糖誘導的炎癥反應中，THP?1細胞中核蛋白HDAC4明顯增加，而胞漿蛋白中HDAC4減少；但異氟烷預處理后的THP?1細胞中核蛋白的HDAC4明顯降低，而胞漿蛋白中HDAC4增加；同時總蛋白的HDAC4表達無明顯變化。有研究［15］表明，高糖能誘導足突細胞中HDAC4進入細胞核，抑制STAT1啟動子區域的乙酰化，從而調節炎癥凋亡等過程。因此，筆者認為在脂多糖誘導的炎癥反應中，THP?1細胞中的HDAC4核轉位激活炎癥相關的信號通路，從而促進下游炎癥因子的釋放；相反，異氟烷預處理后再給予脂多糖刺激THP?1細胞，則誘導HDAC4從細胞核到胞漿，抑制炎癥相關的信號通路。在整個過程中，HDAC4的表達并無明顯改變，異氟烷預處理是通過誘導HDAC4在胞核?胞漿移動，從而調節炎癥因子的釋放。本研究的創新點在于首次從組蛋白乙酰化修飾的角度探討異氟烷預處理抑制炎癥因子的潛在機制，但仍需進一步實驗明確不同的HDACs在異氟烷預處理中的作用。

綜上所述，本研究證明了HDAC4在異氟烷預處理抑制炎癥因子中的作用。結果提示，異氟烷預處理通過抑制HDAC4核移位，從而抑制HDAC4介導的炎癥因子釋放。但目前，關于HDACs在異氟烷預處理中的作用研究仍處于起步階段，其對生物學行為調控的具體機制仍未完全闡明，仍需進一步的實驗研究。