多囊卵巢綜合征卵泡液代謝輪廓分析及對(duì)IVF?ET妊娠結(jié)局的影響

曾偉宏 李子濤 陳創(chuàng)奇 梁嘉穎 歐陽海梅 梁金群 謝汛杰 陳暖 江劍輝

廣東省婦幼保健院（廣州 511442）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS），尤其是難治性PCOS患者，在進(jìn)行IVF?ET時(shí)高雄激素易發(fā)生卵巢過度刺激綜合征，存在卵細(xì)胞質(zhì)量下降，受精率降低等難點(diǎn)問題。近年來隨著代謝組學(xué)的興起，逐漸成為生命科學(xué)研究熱點(diǎn)，并有效應(yīng)用于IVF?ET中，尤其是卵泡液代謝組學(xué)的研究越來越受到重視。研究表明卵泡液相關(guān)代謝物如糖類、激素等可預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能，而PCOS患者內(nèi)分泌疾病機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變直接或間接影響卵泡液微環(huán)境，使其物質(zhì)組成和代謝水平變得更復(fù)雜更多樣性。因此，本研究通過質(zhì)譜代謝組學(xué)分析，對(duì)PCOS和對(duì)照組的卵泡液進(jìn)行全面的氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸代謝物定性和定量分析，尋找差異性代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步完善PCOS卵泡液代謝譜，為改善卵母細(xì)細(xì)質(zhì)量、優(yōu)化卵子培養(yǎng)液提供可靠依據(jù)，為探討胚胎發(fā)育潛能和提高妊娠率提供早期、無創(chuàng)、準(zhǔn)確可靠的方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選自2016年7月至2017年8月期間廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥中心確診的PCOS患者80例，年齡22～42歲，平均（28.5±4.5）歲。因輸卵管因素或男方因素致女性不孕者為正常對(duì)照組85例，年齡24～39歲，平均（29.0±5.3）歲。多囊卵巢綜合征入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)參照2003年歐洲人類生殖和胚胎學(xué)會(huì)與美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)頒布的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［1］：（1）稀發(fā)排卵或無排卵；（2）高雄激素血癥或高雄激素的臨床表現(xiàn)（如多毛、痤瘡等）；（3）超聲表現(xiàn)為卵巢多囊樣改變：一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2～9 mm的卵泡數(shù)≥12個(gè)，或（和）卵巢體積≥10 mL。符合上述3條中的2條，同時(shí)排除：（1）高雄激素血癥的其他原因；（2）高泌乳素血癥；（3）甲狀腺疾病；（4）先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥；（5）庫欣綜合征；（6）分泌雄激素的腫瘤等。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）月經(jīng)規(guī)律；（2）基礎(chǔ)激素水平正常，雙側(cè)竇狀卵泡＞5個(gè)；（3）近6個(gè)月未使用任何甾體激素類藥物；（4）同時(shí)排除：染色體異常，患有精神疾病及性傳播疾病，子宮內(nèi)膜病變、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮畸形；卵巢囊腫等。本研究獲得患者書面同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［第201601067號(hào)］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集和送檢 （1）血液標(biāo)本：所有患者在月經(jīng)周期第3天采取靜脈血2～5 mL，然后1 610×g離心15 min分離血清，立即上機(jī)檢測(cè)。（2）卵泡液標(biāo)本：采用低劑量促性腺激素促排卵方案，采用B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵，選擇直徑為12～18 mm的卵泡穿刺取卵，留取第一管無明顯血染的卵泡液，后立即以1 610×g離心10 min，取上清液分裝于2個(gè)2 mL Eppendorf管中，標(biāo)記后立即檢測(cè)（如無法立即檢測(cè)可置于-80℃冰箱保存待測(cè)）。

1.2.2 儀器和試劑 美國(guó)AB公司API3200串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津GC?MS?QP2010 ultra氣相色譜質(zhì)譜儀，雅培I2000化學(xué)發(fā)光儀，ELX800免疫酶聯(lián)免疫分析儀，艾本德5804R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Tal?boys多管漩渦混合器，博迅GZX?9070MBE電熱干燥箱，天津奧特賽恩MTN?2800W氮吹濃縮裝置。試劑：美國(guó)perkinelmer公司串聯(lián)質(zhì)譜氨基酸與酰基肉堿非衍生化試劑及配套質(zhì)控品，氣相色譜質(zhì)譜有機(jī)酸、脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和流動(dòng)相甲醇均采用美國(guó)SIGMA公司，氫氧化鈉和濃鹽酸采用廣州化學(xué)試劑廠，性激素選用羅氏配套試劑，廣州康潤(rùn)生物抗苗勒管激素（anti?Mullerian hormone，AMH）定量試劑。

1.2.3 血清基礎(chǔ)激素和卵泡液代謝物檢測(cè)

1.2.3.1 基礎(chǔ)激素檢測(cè) 通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清卵泡刺激素（follicle?stimjlating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、孕酮（preg?nendione，PROG）、雌二醇（estradiol，E2）、泌乳素（prolactin，PRL）、睪酮（testosterone，T）；用熒光酶聯(lián)免疫法檢測(cè)AMH激素水平。

1.2.3.2 卵泡液氨基酸檢測(cè) 取卵泡液10 μL置入V型微孔板內(nèi)，每孔添加100 μL工作液（甲醇：氨酸酸內(nèi)標(biāo)液為1∶108，用黏性封膜密封微孔板，確保密封良好，密封后，立即將微孔板置于孵育振蕩器內(nèi)，45℃，650～750 r/min振蕩45 min，每孔轉(zhuǎn)移75 μL萃取液到另一V型微孔板進(jìn)入液相串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)方法條件：（1）流動(dòng)相由甲醇和水以80/20（v/v）的比例組成；（2）流速為1 mL/min；（3）電噴霧器溫度400 ℃；（4）錐孔氣流量50 L/h；（5）質(zhì)譜掃描范圍：100～600 m/z。

1.2.3.3 脂肪酸檢測(cè) 吸取100 μL卵泡液，冰水中冷卻下慢慢加入0.5 mL乙酰氯，沸水浴加熱1 h，然后加入5 mL 6%Na2CO3中和，加入2 mL苯，2 000×g離心5 min，吸取苯層，重復(fù)提取1次并合并苯提取液，用氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL正己烷溶解樣品，采用氣相色譜質(zhì)檢分析系統(tǒng)檢測(cè)GC?MS分析棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、亞油酸脂肪酸及花生四烯酸。實(shí)驗(yàn)方法條件：（1）色譜柱：Rtx?5ms（30 m× 0.25 mm × 1.0 μm）；（2）柱溫：150 ℃保留1 min，以10℃/min速率上升到230℃保留11 min，然后以10℃/min速率降至250℃保留3 min，30℃/min升至300℃保留2.5 min，30℃/min升至320℃保留3 min；（3）進(jìn)樣口溫度：250 ℃；（4）線速度36.8 mL/min；（5）進(jìn)樣方式：分流（10∶1）；（6）色譜質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；（7）質(zhì)譜掃描范圍：50～350 m/z。

1.2.3.4 有機(jī)酸檢測(cè) 取1 mL卵泡液，依次鹽酸羥胺肟化酮酸、乙酸乙酯萃取、N?O?雙（三甲硅基）三氟乙酰胺衍生化有機(jī)酸等步驟后采用GC?MS進(jìn)行分析［2］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)通過均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，區(qū)組使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，均以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（Q）表示，區(qū)組差異使用秩和檢驗(yàn)，區(qū)組陽性率比較使用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)分泌基礎(chǔ)激素情況 PCOS患者年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、血清FSH、E2、PRL與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而LH、PROG、T及AMW明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 患者血清基礎(chǔ)激素濃度水平Tab.1 Basal hormone levels of serum in patients x±s

2.2 PCOS組與對(duì)照組體外受精結(jié)局比較 PCOS組獲卵數(shù)、正常受精率、臨床妊娠率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而胚胎著床率兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 PCOS組和對(duì)照組體外受精結(jié)局情況Tab.2 In vitro fertilization outcome of PCOS group and control group

2.3 卵泡液氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸代謝色譜質(zhì)譜檢測(cè) 通過保留時(shí)間和特征離子進(jìn)行物質(zhì)定性檢測(cè)，樣本根據(jù)內(nèi)標(biāo)法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行定量，比較樣本與標(biāo)準(zhǔn)品離子響應(yīng)強(qiáng)度、峰高或峰面積計(jì)算樣本濃度，代謝物色譜質(zhì)譜圖。PCOS組4種氨基酸：丙氨酸、瓜氨酸、甘氨酸及脯氨酸離子豐度低于對(duì)照組，而精氨酸高于對(duì)照組；PCOS組6種有機(jī)酸：乳酸、2-酮異戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸及3-羥基異丁酸離子豐度高于對(duì)照組（圖1）；PCOS組6種脂肪酸：棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸濃度峰面積高于對(duì)照組。見圖2。

圖1 對(duì)照組和PCOS組有機(jī)酸總離子流圖Fig.1 Organic acids total ion chromatography of control group and PCOS group

圖2 對(duì)照組和PCOS組脂肪酸色譜圖Fig.2 Fatty acids chromatography of control group and PCOS group

2.4 PCOS組與對(duì)照組卵泡液差異代謝物分析 通過檢測(cè)11種氨基酸、6種脂肪酸及135種有機(jī)酸，發(fā)現(xiàn)PCOS組卵泡液丙氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、脯氨酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、乳酸、2-酮異戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸、3-羥基異丁酸高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PCOS組精氨酸低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

卵泡液是卵母細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，是卵母細(xì)胞與周圍細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換和能量代謝的場(chǎng)所，其代謝物組成氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸等對(duì)卵母細(xì)胞的成熟發(fā)揮著重要作用［3］，并且能間接反映卵母細(xì)胞代謝水平［4］。本研究通過分析卵泡液氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸代謝譜，同時(shí)測(cè)定患者血清性激素和AMH濃度水平，結(jié)果顯示PCOS組血清LH、T、PROG、AMH明顯高于對(duì)照組，過高的T易導(dǎo)致高E2血癥從而增加卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生率，AMANO等［5］報(bào)道卵泡液中過低的酪氨酸濃度也易發(fā)生OHSS，而沈亞等［6］報(bào)道成熟卵泡越多，卵子質(zhì)量越好，血E2將越高。本研究PCOS組血E2及卵泡液酪氨酸與對(duì)照組無明顯差異，一方面反映PCOS組卵巢并未受到過度刺激，另一方面提示兩組中的E2不能單獨(dú)反映卵泡質(zhì)量及胚胎質(zhì)量。過高LH可使卵細(xì)胞質(zhì)量下降，可能導(dǎo)致PCOS組比對(duì)照組受精率更低，從而影響妊娠。PCOS患者卵泡發(fā)育異常與高AMH有關(guān)，過高的AMH可抑制PROG的分泌，而PCOS組血PROG水平并沒有低于對(duì)照組，可能是AMH要達(dá)到一定濃度才能抑制顆粒細(xì)胞分泌PROG，這間接說明PCOS患者血雄激素和LH與AMH協(xié)同作用更強(qiáng)。國(guó)外有報(bào)道［7］，通過分析PCOS患者血清和卵泡液AMH關(guān)系，血清AMH是預(yù)測(cè)卵巢過度刺激綜合征風(fēng)險(xiǎn)率的良好指標(biāo)。

表3 患者卵泡液代謝物分析（中位數(shù)，四分位數(shù)間距）Tab.3 Analysis of the metabolites of follicular fluid in patients（M，Q） μmol/L

本研究通過比較正常對(duì)照組和PCOS組代謝譜，發(fā)現(xiàn)PCOS組5種氨基酸、6種有機(jī)酸及6種脂肪酸與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中PCOS組卵泡液精氨酸明顯增高，而精氨酸與獲卵數(shù)及獲胚數(shù)呈負(fù)相關(guān)［8］，這可能是導(dǎo)致妊娠結(jié)局獲卵數(shù)PCOS組少于正常對(duì)照組的原因。有報(bào)道谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸濃度與囊胚形成呈正相關(guān)［9］，N-乙酰半胱氨酸可改善卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量［10］，本研究PCOS患者卵泡液除丙氨酸、甘氨酸外，瓜氨酸及脯氨酸也低于正常對(duì)照組，卵泡液氨基酸一種或多種的改變提示可影響卵母細(xì)胞發(fā)育潛能，可能對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生積極影響。脂肪酸是卵母細(xì)胞提供能源的主要物質(zhì)，NIU等［11］報(bào)道PCOS患者卵泡液與血清中主要卵泡液油酸、棕櫚酸、硬脂酸、十一烷酸以及亞油酸水平顯著升高，與本研究PCOS組中油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸以及花生四烯酸均高于對(duì)照組相符。有報(bào)道［12］受精并卵裂與受精未卵裂患者卵泡液脂肪酸，后者飽和脂肪酸升高、不飽和脂肪酸降低，而且胚胎碎片得分與其卵泡液中油酸含量呈正相關(guān)。過高的脂肪酸有可能影響卵泡液葡萄糖的利用及其轉(zhuǎn)運(yùn)［13］，從而對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局產(chǎn)生重要影響。有機(jī)酸是氨基酸、脂肪、糖代謝過程中所產(chǎn)生的羧基酸，卵泡液有機(jī)酸增高是某種酶缺乏造成代謝障礙原因之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)卵泡液有機(jī)酸研究報(bào)道甚少，上海交通大學(xué)夏蘭在反復(fù)IVF失敗患者卵泡液分析中［14］，發(fā)現(xiàn)氨基己二酸、6-硝基-2-氨基己酸、氨基丙酮酸、3-羥丁酸、戊二酸、甲基-2-酮基丁酸高于1次行IVF?ET成功妊娠者，且代謝機(jī)制未明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PCOS組乳酸、2-酮異戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸、3-羥基異丁酸高于對(duì)照組。高乳酸可能與卵母細(xì)胞在利用葡萄糖、脂肪酸等能量物質(zhì)過程中發(fā)生代謝障礙造成丙酮酸增高，進(jìn)而產(chǎn)生大量的乳酸，過多的乳酸和二羧基酸（2-酮異戊酸酸，戊二酸，3-羥基異丁酸）會(huì)給卵母細(xì)胞發(fā)育及成熟造成不利影響。

綜上所述，卵泡液代謝輪廓分析能較客觀、全面、準(zhǔn)確、無創(chuàng)地反映胚胎的發(fā)育潛能，可作為胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估的補(bǔ)充，但卵泡液成分復(fù)雜，任何改變微環(huán)境的物質(zhì)或因子都可能影響妊娠結(jié)局，除上述氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸可影響妊娠結(jié)局之外，同時(shí)還與患者的激素水平、肥胖和胰島素抵抗［15］等因素有關(guān)，因此應(yīng)從多方面、多因素進(jìn)行綜合分析評(píng)估，不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，提高胚胎妊娠率。