參附強心合劑對心衰大鼠心肌能量代謝AMPK-PGC-1α通路的影響

周 凡 方 偉 祝光禮

心力衰竭是臨床極為常見的危重癥，是目前心血管領域非常重要的一項公共健康問題。調查研究[1-2]表明，國外人群中心力衰竭的得病率約為1.5%～2%，65歲以上人群得病率達到6%-10%，我國的得病率相比國外稍低，但也達到0.9%。心衰時心肌能量代謝發生改變，葡萄糖代謝和脂質異常，引起代謝循環代謝底物—游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）逐漸增多，加重能量代謝障礙，損傷線粒體功能，AMPKPGC-1α通路在心力衰竭能量代謝重構中意義重大。本課題采用腹主動脈縮窄法制做心衰大鼠模型，以曲美他嗪為陽性對照，通過對血清B型腦尿鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）、FFA、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）及單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化 AMPK（phosphorylation ofAMP-activated protein kinase，P-AMPKα）、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（peroxisome pro-liferatorsactivated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α） 的檢測，觀察指標進一步明確參附強心合劑對心衰大鼠心肌能量代謝AMPK-PGC-1α通路的影響，以此闡明參附強心合劑對治療心衰的機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 SD雄性大鼠，清潔級，體質量（140±10）g，由浙江省實驗動物中心提供。動物質量許可證號：SCXK（浙）2013-0016。分籠飼養，保持室內恒溫，溫度（24±1）℃，相對濕度（55±5）%，通風 8～15 次/h，標準飼料，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 主要藥物 參附強心合劑（紅參3g，附子5g，葶藶子10g，玉竹15g，煎煮濃縮成2g/mL的生藥煎劑，由杭州市中醫院制劑室提供）；鹽酸曲美他嗪片（規格：30mg/片，批號2006150，施維雅制藥有限公司生產）。

1.3 主要試劑 戊巴比妥鈉（上海西堂生物科技有限公司，批號151121），BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊 GE公司，批號 PLL-2016-11），PVDF膜（杭州達文生物有限公司，批號R8AA4656C）、Anti-AMPK alpha 1抗體（abcam）、Anti-PGC1 alpha抗體（abcam）。

2 實驗方法

2.1 動物模型及分組 選取雄性SD大鼠共60只，從中隨機取8只作為假手術組，余為手術組。稱重后根據每只大鼠的體質量分別用配置好的3%戊巴比妥鈉（1mL/kg）麻醉。將麻醉后的大鼠固定于鼠板上，在腹部正中做一個約2cm的切口，鈍性分離腹主動脈，沿腹主動脈找腎動脈分支，在該分支上方約2mm處將特殊處理的7號針頭與腹主動脈用4號縫合線一起結扎，抽出探針，形成腹主動脈大約50%狹窄，同時腹腔內注射10萬單位青霉素，關腹縫合。假手術組僅分離出腹主動脈，不行縮窄術。所有大鼠均喂予標準飼料，自由飲水。造模4周后，分別隨機從假手術組與手術組中取6只大鼠共12只，采用眼眶采血法取血，檢測血清腦鈉肽水平以判定造模是否成功。

2.2 分組及給藥 將造模成功且存活的40只大鼠，隨機分為模型組（n=8），參附強心合劑高劑量組（n=8），參附強心合劑中劑量組（n=8），參附強心合劑低劑量組（n=8），曲美他嗪組（n=8）。于造模后第 5周開始藥物溶液灌胃，每日定時灌胃一次。假手術組與模型組則用等量生理鹽水灌胃；中藥組參照陳奇主編的《中藥藥理實驗方法學》[3]中關于動物與人體體質量折算表來計算，按60kg成人1天1帖參附強心合劑（共生藥量33g），低、中、高各劑量1:2:4的比例來算，參附低劑量組為3.45g/kg，參附中劑量組為6.88g/kg，參附高劑量組為13.75g/kg。西藥組參照陳淑云主編的《藥理實驗方法學》[4]中關于人與動物間體表面積折算的等效劑量比值表來計算，60kg成人1天服用曲美他嗪95mg，大鼠的等效劑量為曲美他嗪9.98mg/kg。給藥時間4周。

2.3 標本的收集與檢測 末次給藥24h后處死大鼠，并取腹主動脈血、左心室組織等。采用ELISA法檢測血清BNP、FFA、LDH含量；用Western blot法檢測心肌組織AMPK、p-AMPK、PGC-1α蛋白含量，各蛋白至少重復3次。

2.4 統計學方法 應用SPSS19.0軟件對數據進行分析統計，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，方差齊者，多組間采用one-way ANOVA，組間兩兩比較用配對零均值檢驗法；方差不齊者，采用Dunnett T3檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠BNP、LDH、FFA含量比較 與假手術組比較，模型組BNP、LDH、FFA水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組 BNP、LDH、FFA水平均顯著降低（P＜0.05）；其中，中藥高劑量組 BNP、FFA水平與曲美他嗪組無顯著差異（P＞0.05）；中藥高、中劑量組LDH水平與曲美他嗪組之間無顯著差異（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組心衰大鼠血清BNP、LDH、FFA 含量（ng/mL，x±s）

3.2 各組大鼠AMPK、p-AMPK、PGC-1α表達比較

各組AMPK蛋白表達水平未見顯著差異（P＞0.05）。與假手術組比較，模型組p-AMPK、PGC-1α蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，中藥高劑量組p-AMPK蛋白表達與曲美他嗪組均明顯增加（P＜0.01），中藥高劑量組與曲美他嗪組之間未見明顯差異（P＞0.05）；各用藥組 PGC-1α蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），且中藥各劑量組PGC-1α蛋白表達與曲美他嗪組之間無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

4 討論

在中醫古籍中并無“心衰”病名的記載，但總結其病因病機、癥候，多歸于中醫“痰飲”、“心悸”、“喘癥”、“水腫”等的范疇。原明忠老教授[5]認為，“心氣虛”是心衰的根本原因和病理基礎。馬金等[6]總結臨證經驗，指出氣虛進一步導致“陽虛”，終致心脈瘀阻，痰濁水濕內停。而心陽不能下溫腎陽，心腎水火失濟，致使腎虛不化，腎脈瘀阻，最終陽虛及陰，導致陰陽俱虛，陰不斂陽，陽氣虛脫[7]。由此可見，益氣溫陽之法在心衰治療中的地位。祝光禮教授在長期臨床經驗中，結合中醫對心衰病因病機的認識，以益氣溫陽利水為立論，在歷史名方參附湯基礎上加入葶藶子與玉竹，立方參附強心合劑。原方參附湯源于《婦人良方》，功用回陽救逆，益氣固脫；葶藶子可降氣平喘利水，使水道通調，肺氣清肅，玉竹滋陰養心，還可牽制附子，避免其助陽太過。現代研究[8]認為，參附注射液能夠使心肌細胞的總腺苷酸池、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、腺苷二磷酸（ADP）、磷酸腺苷（AMP）含量明顯提高，具有保護心肌能量代謝的作用。另外，參附湯還能抑制參與心肌能量代謝的Ca-NFAT3信號轉導通路活性，改善心功能。

表2 各組心衰大鼠AMPK、p-AMPK、PGC-1α半定量比值（ng/mL，x±s）

BNP是判定心衰的重要生化指標，LDH活性也是判斷細胞壞死程度的重要指標之一。心衰時FFA利用減少造成心臟脂質沉積，發生脂質代謝異常，加重能量代謝障礙，損傷線粒體功能。在本次實驗中，觀察用血清Elisa法測定的各項指標發現，中藥各組能降低BNP、LDH、FFA水平，且劑量越高降低幅度越大，其中BNP水平提示中藥高劑量組與西藥組作用相似；LDH、FFA水平提示高劑量和中劑量組與西藥組作用相似。從該實驗結果看，參附強心合劑可能通過減少心肌細胞壞死，加強游離脂肪酸氧化供能，改善脂質代謝，從而一定程度上改善心衰大鼠心肌能量代謝。

AMPK在機體內是重要的調控因子，是細胞能量變化感受器，可調節下游多組通路，調控細胞凋亡、能量代謝等進而影響機體各種疾病的發生與發展。在線粒體保護方面，AMPK可首先激活PGC-1α。PGC-1α是重要的促線粒體生物合成因子，能夠調節線粒體數量和質量，參與脂肪酸氧化過程[9]。從本實驗結果看，參附強心合劑可能通過激活AMPKPGC-1α作為參與線粒體生物合成及功能狀態有關的信號通路，提高p-AMPK、PGC-1α的表達，降低血清FFA水平以調節脂肪酸氧化代謝及葡萄糖轉運，改善心衰大鼠心肌能量代謝，減少FFA對內皮損傷作用，并促進線粒體生物合成。綜上所述，參附強心合劑在一定程度上能夠改善心衰大鼠的心肌能量代謝重構，從而起到治療心衰的作用。