三黃連散的亞慢性毒性試驗(yàn)研究

陳燕晴，吳苑瀅，梁萬文，施 君，韋英益，胡庭俊*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530022)

三黃連散是由黃連、黃芩、大黃和連翹提取物加適宜輔料，經(jīng)混合制成的中藥散劑，具有清熱解毒之效，用于羅非魚鏈球菌病的預(yù)防和治療。研究表明，中草藥提取物復(fù)方制劑中的有效成分分別作用于不同的靶點(diǎn)，發(fā)揮抗菌抗炎等作用[1]。黃芩苷是一種從黃芩的干燥生根中提取的生物活性黃酮，具有抗菌[2]、抗炎[3]、抗寄生蟲[4]等的作用，連翹苷具有解熱抗炎[5]和抗氧化[6]等的功效，含有黃芩苷和連翹苷成分的中藥方劑具有清熱解毒，提高機(jī)體免疫力的效果。相關(guān)研究表明，復(fù)方藥與單方藥相比，在用藥量和藥效方面具有較多優(yōu)勢。周永梅等[7]的研究表明，黃芩甙、燈盞花乙素合用時(shí)對人頰癌細(xì)胞株(HB)的抑制率隨藥物濃度的增加而升高，對細(xì)胞株的抑制與二者單用時(shí)相比較，所用藥物的濃度降低而作用更強(qiáng)，存在明顯差異。狄斌等[8]的研究表明，復(fù)方雙黃連顆粒劑比黃芩顆粒劑在黃芩苷的代謝產(chǎn)物存在明顯差異，復(fù)方配伍促進(jìn)了總黃芩素在膽汁中的排泄。市場上現(xiàn)有的方劑主要有雙黃連粉劑、雙黃連制劑[9]等，而三黃連散的相關(guān)研究還未見任何報(bào)道。

因此，試驗(yàn)通過參考本課題組前期的急性毒性結(jié)果，確定了亞慢性毒性試驗(yàn)的最大劑量。連續(xù)30 d經(jīng)口給予大鼠不同劑量的三黃連散，預(yù)測受試物可能引起的臨床毒性反應(yīng)、臨床毒性靶器官或靶組織，評(píng)估該藥劑臨床應(yīng)用的安全性，為臨床用藥劑量設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 三黃連散，廣西大學(xué)、廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院共同研制，山西首愛動(dòng)物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)；每g含黃芩苷不少于80 mg；1000 g/袋。按試驗(yàn)分組，于粉碎后的基礎(chǔ)日糧中加入不同質(zhì)量的三黃連散，而后制作成型，58 ℃烘干至質(zhì)量恒定備用。

1.2 主要儀器 日本Hitachi-7180全自動(dòng)生化分析儀，配套試劑購自美康生物科技公司；日本Sysmex-2100全自動(dòng)血液分析儀及其配套試劑;ZT-12M生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠100±20 g，80只，雌雄各半，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0003。飼養(yǎng)條件：室溫22～27 ℃，相對濕度40%～75%。試驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)5 d。

1.4 分組與給藥 將80只大鼠隨機(jī)分為4組，即空白對照組，三黃連散低劑量組(2.5 g/kg·BW)、中劑量組(5.0 g/kg·BW)和高劑量組(10.0 g/kg·BW)，每組20只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。自由飲水(雙蒸水)。采用混飼給藥的方式連續(xù)給藥30 d，停藥后繼續(xù)觀察7 d。每組按基礎(chǔ)日糧喂養(yǎng)。

1.5 臨床觀察及檢測項(xiàng)目 每天觀察大鼠的健康狀況，記錄大鼠飼料消耗量(飼料消耗量(g)=每日給料量-每日剩料量)，每周稱重一次。于第31 d和停藥后第8 d，每組隨機(jī)抽取雌雄各半大鼠10只，進(jìn)行眼球采血，全血用于血常規(guī)測定，血清用于血液生化指標(biāo)測定；后處死，進(jìn)行解剖學(xué)檢查，取心、肝、肺、腎、胃、腸、胸腺、卵巢子宮、睪丸進(jìn)行稱重，計(jì)算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器重mg/體重g)；用10%的福爾馬林固定，用于組織病理學(xué)檢查。

1.6 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件比較進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般觀察 整個(gè)試驗(yàn)期間，各給藥組大鼠的外觀、毛發(fā)、行為、糞便未見明顯異常，與空白對照組比較均無差異，且未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。說明三黃連散對大鼠無明顯的不良影響。

2.2 體重和飼料消耗量 給藥第21 d，雌性大鼠中、低劑量組的體重顯著高于空白對照組(P<0.05)，高劑量組的體重顯著低于空白對照組(P<0.05)；給藥第30 d，與空白對照組比較，雌性大鼠高劑量組的體重極顯著降低(P<0.01)，中、低劑量組差異不顯著(P>0.05)；停藥7 d，各組大鼠的體重差異不顯著(P>0.05)。自給藥第21 d起，雄性大鼠高劑量組的體重均極顯著低于同期的空白對照組(P<0.01)；給藥第30 d，中劑量組雄性大鼠的體重顯著低于空白對照組(P<0.05)(圖1)。

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。下同圖1 三黃連散亞慢性毒性試驗(yàn)的大鼠體重變化Fig 1 Changes of rat's body weight in subchronic toxicity test of Sanhuanglian powder

給藥第14 d，雌性大鼠中、高劑量組的飼料消耗量和空白對照組比較顯著升高(P<0.05)；給藥第21 d，高劑量組的飼料消耗量和空白對照組比較極顯著降低(P<0.01)；給藥第30 d和第37 d，低、中劑量組的飼料消耗量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，高劑量組的飼料消耗量極顯著低于空白對照組(P<0.01)。給藥第21 d起，雄性大鼠中、高劑量組的飼料消耗量顯著低于同期的空白對照組(P<0.05)(圖2)。

圖2 三黃連散亞慢性毒性試驗(yàn)大鼠的飼料消耗量Fig 2 Feed consumption of rats with subchronic toxicity test in Sanhuanglian powder

2.3 血常規(guī)檢查結(jié)果 給藥30 d后，和空白組相比，雌性大鼠的中、低劑量組的中性粒細(xì)胞極顯著降低(P<0.01)；雄性大鼠的高劑量組淋巴細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)，中劑量組顯著降低(P<0.05)，高劑量組中性淋巴細(xì)胞顯著升高(P<0.05)。停藥7 d后，雄性大鼠的中、低劑量組淋巴細(xì)胞顯著降低(P<0.01)(表1、表2)。

2.4 血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果 給藥30 d后，與空白對照組相比，雌性大鼠低劑量組TG顯著降低(P<0.05)，中、低劑量組GLU極顯著降低(P<0.01)，三個(gè)劑量組的TBL均極顯著升高(P<0.01)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；雄性大鼠高劑量組ALT、BU顯著降低(P<0.05)，高、中劑量組TC顯著降低(P<0.05)；中劑量組GLU顯著降低(P<0.05)，三個(gè)劑量組的TBL均極顯著升高(P<0.01)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。停藥后7 d，與空白對照組相比，雌性大鼠高劑量組BU顯著降低(P<0.05)，中劑量組BU極顯著降低(P<0.01)，高劑量組TG極顯著升高(P<0.01)，高劑量組TC顯著升高(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；雄性大鼠高劑量組ALT、AST顯著降低(P<0.05)，高、中劑量組BU顯著降低(P<0.05)，低劑量組CRE顯著降低(P<0.05)，高、中劑量組GLU顯著降低(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0.05)(表3、表4)。

表1 三黃連散處理30 d 的大鼠血常規(guī)指標(biāo)測定結(jié)果Tab 1 Hematological values of rats treated with Sanhuanglian Powder for 30 days(mean±S.D.)

與空白對照組比較，“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)。下同

表2 停藥后7 d大鼠血液學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果Tab 2 Hematological values of rats on Day 7 post last treatment (mean±S.D.)

表3 三黃連散處理30 d大鼠的血清生化指標(biāo)測定結(jié)果Tab 3 Serum biochemical index of rats treated with Sanhuanglian Powder for 30 days(mean±S.D.)

表4 大鼠停藥后7 d血清生化指標(biāo)測定結(jié)果Tab 4 Serum biochemical index of rats on Day 7 post last treatment (mean±S.D.)

2.5 臟器指數(shù) 給藥30 d，與空白對照組比較，雌性大鼠中劑量組的胃臟器指數(shù)顯著下降(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；雄性大鼠三個(gè)劑量組的胃臟器指數(shù)均極顯著下降(P<0.01)，高劑量組心臟器指數(shù)顯著下降(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。停藥7 d后，與空白對照組比較，雌性大鼠中、低劑量組腎臟器指數(shù)均顯著上升(P<0.05)，中、低劑量組胃臟器指數(shù)均顯著下降(P<0.05)，高劑量組心臟器指數(shù)顯著下降(P<0.05)，中劑量組卵巢子宮臟器指數(shù)顯著上升(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；雄性大鼠三個(gè)劑量組的胃臟器指數(shù)均顯著下降(P<0.05)，高劑量組胸腺和睪丸臟器指數(shù)均顯著下降(P<0.05)，其余指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表5、表6)。

表5 三黃連散處理30 d大鼠的臟器指數(shù)Tab 5 The organ indexs of rats treated with Sanhuanglian powder for 30 days (mean±S.D.)

表6 大鼠停藥后7 d臟器指數(shù)的測定結(jié)果Tab 6 The organ indexs of rats on Day 7 post last treatment(mean±S.D.)

2.6 病理組織學(xué)檢查 給藥30 d和停藥一周后，對大鼠進(jìn)行剖檢，逐個(gè)觀察各臟器，各劑量組大鼠的內(nèi)臟均無肉眼可見病理變化。取各劑量組大鼠的心、肝、肺、腎、胃、腸、卵巢、子宮、睪丸、胸腺等主要臟器做石蠟切片，用于病理組織學(xué)檢查。在低倍鏡和高倍鏡下觀察各內(nèi)臟器官組織切片，高、中、低劑量組與空白對照組比較亦無明顯組織學(xué)病變。(圖3～圖11)

A、E 高劑量組；B、F 中劑量組；C、G 低劑量組；D、H空白組A、B、C、D表示給藥30d；E、F、G、H表示停藥后7d。下同A、E: High dose group; B、F: Medium dose group; C、G: Low dose group; D、H: black groupA、B、C、D represent on Day 30 post treatment; E、F、G、H represent Day 7 post last treatment. The same as follows圖3 給藥30 d后和停藥一周后大鼠心臟病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 3 Histopathological figure of the heart of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

圖4 給藥30 d后和停藥一周后大鼠肝臟病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 3 Histopathological figure of the liver of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

圖5 給藥30 d后和停藥一周后大鼠肺臟病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 5 Histopathological figure of the lung of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

圖6 給藥30 d后和停藥一周后大鼠腎臟病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 6 Histopathological figure of the kidney of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

圖7 給藥30 d后和停藥一周后大鼠胃病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 7 Histopathological figure of the gastric of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

圖8 給藥30 d后和停藥一周后大鼠腸病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 8 Histopathological figure of the intestinal of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

圖9 給藥30 d后和停藥一周后大鼠卵巢病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 9 Histopathological figure of the ovary of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

圖10 給藥30 d后和停藥一周后大鼠睪丸病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 10 Histopathological figure of the testis of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

A、C 高劑量組； B、D空白組A、B表示給藥30d；C、D表示停藥7d后A、C: High dose group; B、D: Black groupA、B represent on Day 30 post treatment; C、D represent Day 7 post last treatment.圖11 給藥30 d后和停藥一周后大鼠脾臟病理組織學(xué)(HE 200×)Fig 11 Histopathological figure of the spleen of rat on Day 30 post first treatment and Day 7 post last treatment

3 討論與結(jié)論

亞慢性毒性試驗(yàn)是對試驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)多日給予受試物所致生物學(xué)效應(yīng)的毒理學(xué)評(píng)價(jià),可獲得重要的毒理學(xué)參數(shù)[10]。研究過程中，各試驗(yàn)組未出現(xiàn)大鼠死亡情況，且所有大鼠的精神狀態(tài)、行為、飲食等無異常。給藥第21 d內(nèi)，雌、雄大鼠高劑量組的飼料消耗量極顯著降低(P<0.01)，但第21 d起，雌、雄大鼠高劑量組的體重都顯著低于空白對照組(P<0.05)，說明高劑量的三黃連散可能影響大鼠食欲，降低對飼料的攝入，進(jìn)而影響大鼠的體重。這與復(fù)方雙黃連口服液影響動(dòng)物適口性相似[11]。

血液常規(guī)指標(biāo)的變化可以反映動(dòng)物機(jī)體的某些病理狀態(tài)，中性粒細(xì)胞具趨化作用、吞噬作用和殺菌作用，淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分，而應(yīng)激情況下大鼠的血液學(xué)和血生化指標(biāo)也會(huì)發(fā)生差異[12]，不同血樣處理方式對大鼠的生化指標(biāo)的也有影響[13-14]，麻醉劑的選擇同樣也影響大鼠的部分生化指標(biāo)結(jié)果[15]。給藥后30 d，雌性大鼠的中、低劑量組中性粒細(xì)胞，雄性大鼠的高、中劑量組淋巴細(xì)胞、高劑量組中性粒細(xì)胞與空白對照組相比均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均在正常范圍內(nèi)；停藥后7 d，各組的血液學(xué)指標(biāo)與空白對照組比較差異不顯著(P>0.05)。由此說明三黃連散對大鼠血液常規(guī)基本無影響。

黃雪峰等[16]的研究表明黃芩苷含量在肝臟分布較高，其次是心臟和腎臟。ALT、AST是肝功能的主要指標(biāo)之一，當(dāng)肝損害時(shí)這些酶由細(xì)胞內(nèi)大量釋放到血液中，導(dǎo)致血清中的含量升高，因此這兩種酶濃度升高是肝臟受到損害的一種應(yīng)答反應(yīng)。TBL含量升高也是肝臟受損的重要標(biāo)志，可能是肝細(xì)胞黃疸或溶血性黃疸、梗阻性黃疸。肝臟是TG、TC合成清除的主要器官，當(dāng)血液中TG、TC含量升高，則提示肝臟受損。血清中蛋白水平TP、ALB也能指示肝臟是否受損，水平升高提示肝臟受損，水平降低則提示肝臟慢性損傷[10]。BU、CRE、GLU是反應(yīng)腎臟功能的重要指標(biāo)，當(dāng)腎功能受損時(shí)，血清中尿素、肌酐、葡萄糖的水平會(huì)上升。本次試驗(yàn)中，給藥后30 d，雌性大鼠低劑量組的TG顯著低于空白對照組(P<0.05)；雄性大鼠高劑量組ALT、BU兩次血生化檢測均顯著低于空白對照組(P<0.05)；停藥后7 d雌性大鼠高、中劑量組BU均顯著降低，雄性大鼠低劑量組CRE也顯著降低，均不指示毒性作用。給藥30 d，雌雄大鼠藥物組的TBL均極顯著升高(P<0.01)，停藥后7 d，則與空白對照組差異不顯著，提示可能在服用高劑量組藥物時(shí)對肝產(chǎn)生影響，但停藥后該影響即消失，與相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道比較，該TBL值在正常范圍[17,18]。停藥后7 d，雌性大鼠高劑量組TC和TG顯著高于空白對照，但其變化在正常參考值范圍內(nèi)(1.73～3.15 mmol/L，0.52～1.22 mmol/L)。由此說明三黃連散對大鼠血液生化指標(biāo)基本無影響。

臟器指數(shù)在一定程度上可以反映受試物對臟器的影響[10]。給藥后30 d，雌性大鼠中劑量組的胃指數(shù)顯著下降(P<0.05)，且停藥7 d后，中、低劑量組胃指數(shù)均顯著下降(P<0.05)；雄性大鼠三個(gè)劑量組的胃指數(shù)在兩次檢測結(jié)果均顯示極顯著或顯著下降(P<0.01，P<0.05)，提示藥物可能對大鼠胃指數(shù)有影響，這可能是大鼠飼料消耗量和體重減少的原因。給藥前后雌雄大鼠的肝臟指數(shù)與空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；停藥7 d后，雌性大鼠中低劑量組腎臟指數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)，雄性大鼠的腎臟指數(shù)與空白對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥30 d，雄性大鼠高劑量組心臟指數(shù)顯著下降(P>0.05)，但停藥7 d后差異不顯著(P>0.05)；停藥7 d后，雌性大鼠中劑量組卵巢子宮臟器指數(shù)顯著上升(P>0.05)；雄性大鼠高劑量組睪丸指數(shù)顯著下降(P<0.05)。但上述指標(biāo)的改變?nèi)狈┝糠磻?yīng)關(guān)系，不能證明藥物有毒性作用。大體解剖以及病理切片檢查結(jié)果顯示，心、肝、脾、肺、腎、胃腸、卵巢子宮或睪丸等主要臟器的組織結(jié)構(gòu)清晰，無可見的病理變化。

前人研究表明，黃芩根部提取的類黃酮采用靜脈內(nèi)注射給藥大鼠，LD50為286.15 mg/kg[19]，連續(xù)90 d靜脈注射Beagle犬，60mg/kg未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)[20]。四倍體黃芩D20的無可見有害作用水平(NOAEL)為10g/kg[21]。郗玉玲[22]等的研究表明，口服黃芩莖葉總黃酮可顯著提高用藥的安全性，LD50值為14.87 g/kg，相當(dāng)于小鼠藥效學(xué)試驗(yàn)最大劑量的68.5倍。張喜平等[23]的研究表明，將黃芩苷粉以最大濃度小鼠灌胃給藥，小鼠沒有出現(xiàn)死亡，其最大給藥量為15 g/kg，具有較好的安全性。柳璐等[24]的研究表明，連翹苷對大鼠無長期毒性作用。艾霞等[25]的研究表明，連翹葉水提取物為無毒性物質(zhì)，亦無致突變作用。貫葉連翹提取物給SD大鼠灌胃用藥的安全劑量為0.3 g/kg[26]。吳苑瀅等[27]的研究表明，濃縮型獸用雙黃連口服液對小鼠無急性毒性作用，長期連續(xù)用藥也無亞慢性毒性作用，安全性較高。周德剛等[28]的研究也表明，雙黃連口服液對小白鼠最小致死量范圍為49.2～60.8 g/kg ，相當(dāng)于禽臨床用量的111.8～138.2倍，說明雙黃連口服液臨床應(yīng)用具有一定的安全性。這都與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

試驗(yàn)結(jié)果表明，三黃連散給大鼠連續(xù)飼喂30 d未見明顯毒性反應(yīng)。