慶大霉素在羊體內代謝和殘留消除規律研究

胡 劍，孫豐梅，張聰聰，李艷華，陳 剛*

(1.唐山市豐南區農牧局，河北唐山 063300；2.河北北方學院農林科技學院，河北張家口 075000；3.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081)

慶大霉素是由小單孢子屬產生的多組分氨基糖苷類抗生素[1]，主要由慶大霉素C1、C1a、C2和C2a組成，分子量475.9(C1，477.6;C2，463.6;C1a，449.5)[2-3]。可與硫酸結合成在臨床上普遍使用的硫酸慶大霉素[4]，其作用機制是與細菌核糖體30S 亞基結合，抑制細菌蛋白的合成，并間接導致細菌細胞膜、細胞壁的缺損，對靜止期細菌殺滅作用較強，且對許多致病菌有抗生素后效應[5-7]。對多種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、變形桿菌、沙門氏菌等)和金黃色葡萄球菌均有抗菌作用[8]。肌肉注射后吸收迅速而完全。在0.5～1 h達血藥峰濃度。皮下或肌內注射的生物利用度超過90%[9]。主要用于治療動物敏感的革蘭氏陰性和陽性菌感染，如敗血癥、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、胃腸道感染、腹膜炎、乳腺炎及皮膚和軟組織感染以及傳染性鼻炎等[10-12]。我國農業部規定慶大霉素在牛、豬肌肉、脂肪、肝臟和腎臟的殘留限量分為100、100、2000、5000 μg/kg，牛奶、雞肉中的殘留限量200、100 μg/kg[13]，但尚未制定其在羊組織中的最高殘留限量標準。目前世界各國及國內尚未有開展羊組織中慶大霉素代謝和殘留消除規律研究的報道。本文針對慶大霉素在羊體內的代謝分布及殘留消除規律進行了研究，確定慶大霉素在羊體內的殘留靶組織和殘留標示物，以期為安全使用獸藥，正確制訂最高殘留限量標準提供科學依據和建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 水：符合GB/T 6682規定，一級水；慶大霉素標準品(純度≥94%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)；4%硫酸慶大霉素注射液，批號：B75140316，河北遠征藥業；甲醇、乙腈和甲酸(HPLC級，美國Dikma公司)；28%氨水(分析純，國藥集團化學試劑公司)；三氯乙酸(純度≥99%，北京百靈威科技有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(瑞士Sigma Aldrich公司)；磷酸二氫鉀(純度≥94%，北京百靈威科技有限公司)；乙酸銨(色譜純，北京試劑公司)；陽離子交換固相萃取柱PCX(美國Agilent公司，60 mg，3 mL)；HPH C8色譜柱(3.0×100 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)。

1.2 儀器與設備 超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀(Agilent 6470 ΜPLC-QQQ-MS/MS，美國Agilent公司)；天平(德國梅特勒-托利多公司)；漩渦混合儀(MS-3，德國IKA公司)；高速冷凍離心機(德國Thermo公司)；固相萃取裝置；氮吹儀(TTL-DCⅡ，北京同泰聯公司)；真空泵(美國Agilent公司)；Millipore純化水系統(Milli-Q公司)。

1.3 主要溶液的配制 氨化甲醇溶液：量取濃氨水15 mL，用甲醇溶解并稀釋至100 mL；2%三氯乙酸提取液：稱取磷酸二氫鉀1.36 g，用980 mL水溶解，分別加入乙二胺四乙酸二鈉0.15 g和三氯乙酸20 g，溶解混勻并定容至1000 mL；2 mol/L乙酸銨溶液：稱取15.416 g乙酸銨，用水溶解并定容至100 mL；慶大霉素標準貯備溶液：取慶大霉素標準品約10 mg，精密稱定，用水溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標準貯備液，置4 ℃避光靜止保存；慶大霉素標準工作液：準確量取慶大霉素標準貯備液一定量，用0.3%醋酸水稀釋定容成10、50、100、200、500、1000 ng/mL的標準工作液，置4 ℃冰箱中避光保存。

1.4 試驗設計

1.4.1 慶大霉素在羊體內代謝研究

1.4.1.1 試驗動物 動物：健康湖羊5只，平均6月齡，體重20～30 kg，購自北京某羊場。空白對照組1只，試驗組4只(對照組為♀，試驗組Ⅰ、Ⅳ為♀，Ⅱ、Ⅲ為♂)。代謝籠飼養，自由采食飲水，適應1周，飼喂不添加任何抗菌藥物的飼料，試驗前后飼養條件相同。

1.4.1.2 給藥方案 給藥途徑：羊頸部肌內注射(在同一側注射)，每日給藥2次，連續給藥2.5 d；用法與用量：4 mg/kg×體重；第1天：上午9:00；下午3:00；第2天：上午9:00；下午3:00；第3天：上午9:00；第4天上午9:00屠宰。

1.4.1.3 樣品采集和保存 采樣時嚴格遵守動物及動物產品獸藥殘留監控抽樣規范[14]，每頭羊取肌肉300～500 g (腿肌)，皮膚+脂肪200～300 g，雙腎各取1/2(縱切)，肝臟取整葉全肝。用絞肉機充分攪碎混勻；血漿：每日給藥前及給藥后1、3、6、24 h 頸靜脈采血，采集的血液經4000 r/min離心10 min，吸取上清于EP離心管中；尿、糞便：收集給藥后0～6 h，6～12 h，12～24 h全部的尿液和糞便，尿液不離心，直接保存，糞便保存前研磨并混合均勻，包裝后-20 ℃保存。

1.4.2 慶大霉素在羊組織中消除規律研究

1.4.2.1 試驗動物 動物：健康湖羊22只(♂11只，♀11只)，平均6月齡，體重20～30 kg，購自北京某羊場。空白對照組1只，試驗組分7組，每組3只。代謝籠飼養，自由采食飲水，適應一周，飼喂不添加任何抗菌藥物的飼料，試驗前后各組飼養條件相同。

1.4.2.2 給藥方案 給藥途徑：羊頸部肌內注射(在同一側注射)，每日給藥2次，連續給藥3 d；用法與用量：4 mg/kg×體重；第1天：上午9:00；下午3:00；第2天：上午9:00；下午3:00；第3天：上午9:00；下午3:00。

1.4.2.3 樣品采集和保存 最后一次給藥后1、3、5、7、10、20、30 d分別隨機宰殺3頭，采樣時嚴格遵守動物及動物產品獸藥殘留監控抽樣規范，每頭羊取肌肉300～500 g (腿肌)，皮膚+脂肪200～300 g，雙腎各取1/2(縱切)，肝臟取整葉全肝。用絞肉機充分攪碎混勻，包裝后-20 °C保存。

1.5 試驗方法 采用實驗室自建的超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)對樣品進行測定。

1.5.1 樣品前處理 稱取樣品2±0.02 g于50 mL離心管中，加10 mL磷酸鹽緩沖液，渦漩混勻1 min，超聲5 min，以10000 r/min離心10 min。取上清液于另一50 mL離心管中。殘渣再加磷酸鹽緩沖液4 mL，重復提取一次，合并兩次提取液并定容至15 mL，渦旋混勻，為備用液，供SPE凈化。

PCX陽離子交換柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取7.5 mL的備用液上柱，流干后，依次用水5 m和甲醇5 mL淋洗，抽干，用氨化甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液于10 mL塑料離心管中，于40 ℃下用氮氣吹干，用0.3%醋酸水溶液溶解并定容至2 mL，充分渦旋，0.22 μm濾膜過濾，濾液供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.5.2 色譜、質譜條件 色譜儀：seAgilent 1290 lnfinitiyⅡ；色譜柱：Agilent Poroshell HPH-C8(3.0×100 mm，2.7 μm)；柱溫35 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；流動相A：水相(50 mmoL乙酸銨、2%氨水、0.2%甲酸)；流動相B：乙腈。

質譜儀：Agilent 6470三重四級桿MS/MS；離子源：ESI+；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流速：7 L/min；霧化器：40 psi；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；毛細管電壓：3500 V；噴嘴電壓：0 V。

2 結果與分析

2.1 慶大霉素在羊體內代謝研究 因慶大霉素在不同的羊組織、排泄物、血液中濃度范圍相差很大，因此，在定量過程中，對不同基質采取了合適的濃度范圍進行定量，各基質在不同濃度范圍內線性良好，定量方法可行，添加標準品的樣品隨樣品上樣做添加回收實驗，計算方法回收率，結果見表1，標準溶液和添加標準品樣品色譜圖見圖1和圖2。

表1 羊組織、排泄物、血液中慶大霉素的線性方程和回收率Tab 1 Linear equations and recoveries of gentamicin in sheep tissues, excreta, and blood

圖1 25 ng/mL標準品溶液色譜圖Fig 1 Chromatogram of 25 ng/mL standard solution

圖2 羊腎臟添加50 ng/mL標準品色譜圖Fig 2 Chromatogram of sheep kidney with a spiked concentration of 50 ng/mL

用藥期間、停藥期間慶大霉素在羊血液中的殘留代謝規律見表2。每日給藥前及給藥后1、3、6、24 h頸靜脈采血，研究發現肌肉注射慶大霉素后在血液中1 h左右達血藥峰濃度，最高血藥濃度可達133.23 mg/L，給藥后1～6 h血藥濃度迅速下降，再次給藥，重復相同血藥濃度變化規律；最后一次給藥后，血藥濃度不斷下降，24 h后檢測的血藥濃度僅為給藥后1 h的10%左右，表明慶大霉素通過肌肉注射進入羊體，首先進入到血液中，隨后濃度降低，可能隨血液流動循環分布到各器官組織中。

同一劑量多次給藥，用藥和停藥期間分別收集四只羊給藥后0～6、6～12、12～24 h的糞便和尿液。由表3分析得出，慶大霉素在糞便中排泄量較低，沒有明顯的代謝規律，含量最高時僅有168.6 μg；在尿液中，代謝規律明顯，0～6 h濃度最高，隨之減少，連續注射藥物呈現相同代謝變化規律。慶大霉素在尿液中的含量遠遠高于糞便，證明慶大霉素主要通過尿液排出體外。

表2 羊血液中慶大霉素的殘留濃度變化(μg/L)Tab 2 The variation in concentration of residue gentamicin in sheep blood

每日9:00、15:00給藥2次，連用2.5 d。ND：未檢出(Not Detected)

administrated at 9:00 am, 15:00 pm, respectively, for 2.5 days

每日9:00、15:00給藥2次，連用2.5 d。ND: 未檢出(Not Detected)

administrated at 9:00 am, 15:00 pm, respectively, for 2.5 days

表4 羊組織中慶大霉素的殘留濃度(μg/kg)Tab 4 Residual concentration of gentamicin in sheep tissues (μg/kg)

通過表4研究發現，同一劑量多次給藥，停藥24 h后，同一時間點宰殺處理的肝臟、腎臟、肌肉、脂肪，經前處理后通過UPLC-MS/MS檢測，結果顯示慶大霉素在羊腎臟中殘留濃度最高，其次是肝臟，肌肉和脂肪含量很少。

為證明慶大霉素在羊體內不代謝、以原型藥的形式隨尿液排出，在動物試驗中，肝臟、腎臟兩種主要藥物代謝組織取樣后稱重(表5)，所有尿液、糞便(表3)收集完全并記錄，以此計算慶大霉素原型藥總量占注射總量的比例。

表5 肝臟、腎臟中慶大霉素的原型殘留量(mg)Tab 5 The prototype residue of Gentamicin (mg) in liver and kidney

表6 腎臟、肝臟、尿液中原型藥量占注射量的比例(%)Tab 6 The proportion of kidney, liver, urine prototype drugs accounted injection volume

數據表明慶大霉素在羊肌肉、脂肪、糞便和血液中原型藥量較少，通過方法回收率換算后的量遠低于0.5 mg，可忽略不計。由表6得出，肝臟、腎臟、尿液的原型藥量同樣經過換算后，藥量總和分別占注射量的87.7%、89.4%、90.0%、94.3%，一般情況下，經過注射、口服等方式進入動物體內的藥物，最終原型藥量占總注射量的90%以上時，即可認為該藥物在動物體內不被代謝轉化，以原型藥形式排出體外。

2.2 慶大霉素在羊體內消除規律研究 慶大霉素在羊組織中的殘留量隨給藥后的時間變化以近似負指數函數遞減的規律變化，是按照一級動力學的過程在體內消除，即將組織中測得的藥物濃度作對數轉換后，與時間作回歸分析，得到組織中藥物濃度與時間消除曲線方程y=ax+b(y=LnC，b=LnC0)，慶大霉素在羊組織中殘留濃度見表7，殘留消除曲線見圖3。

表7 慶大霉素注射給藥后在羊組織的殘留濃度(μg/kg)Tab 7 Gentamicin residue concentrations (μg/kg) in sheep tissues after intramuscular administration

ND: 未檢出(Not Detected)

圖3 羊組織中慶大霉素的殘留消除曲線Fig 3 The residual elimination curve of gentamicin in sheep tissues

研究表明，按8 mg/kg×體重連續給藥3 d，給藥后1 d時各組織藥物濃度均較高，尤以肝臟、腎臟為主，這兩個組織可能是慶大霉素在羊體內的重要藥理和毒理作用部位。

通過計算得出各組織中慶大霉素的殘留消除參數(表8)。慶大霉素在脂肪中的消除半衰期最短，肌肉中半衰期最長，第1、3天時，肌肉中的慶大霉素比脂肪中殘留量少，但慶大霉素在肌肉中消除緩慢，30 d還可檢測出少量，在脂肪中消除迅速，30 d已基本代謝完。

肝臟、腎臟中的慶大霉素殘留濃度較高：第20 天時，肝臟中的平均濃度為780.33 μg/kg，腎臟為6181.89 μg/kg；第30天時，肝臟中的平均濃度為658.14 μg/kg，腎臟為3613.47 μg/kg，和EMA報道的慶大霉素在牛、豬體內殘留消除規律相近。肝臟和腎臟的消除半衰期也不同，在確定慶大霉素在羊體內的殘留靶組織時要具體分析。

3 討 論

3.1 慶大霉素在羊體內分布和代謝特征 采用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)檢測了慶大霉素在羊的主要組織、尿液、糞便和血液中的分布和代謝情況。按中國獸藥典(2015版)推薦的最大用量[15]肌肉注射，慶大霉素在羊體內1 h可到血藥峰濃度；尿液排泄量最高，通過多次收集給藥后0、3、6 h的尿液，檢測發現尿液排泄總量占注射總量的80%以上，在糞便中不足0.1%；停藥24 h后，慶大霉素在腎臟中殘留濃度最高，其次是肝臟，肌肉和脂肪含量很少，這和歐洲藥品管理局EMEA對慶大霉素在牛體內代謝和分布的報道[16]一致，可能因為牛和羊同為反芻動物，二者代謝途徑相似。參考慶大霉素在其他動物體內不代謝的報道[16-18]，將羊肝臟、腎臟、尿液全部稱重、收集，保存檢測，通過方法回收率換算，得出慶大霉素在羊肝臟、腎臟、尿液中原型藥總量占注射總量90%以上，故得出結論：慶大霉素在羊體內的代謝途徑主要是經血液運輸到腎臟并經腎小球吸收形成原尿，隨尿液排出體外，在羊體內不代謝。與國內外慶大霉素在人、豬、牛體內的代謝報道一致。

表8 羊組織中慶大霉素的殘留消除參數Tab 8 Residual elimination parameters of gentamicin in sheep tissues

3.2 慶大霉素在羊體內殘留標示物的確定 殘留標示物對獸藥在動物體的代謝、消除、殘留的監控和獸藥食品安全具有重要的意義[19]。美國藥品管理局(FDA)規定殘留標示物是指在靶組織中與總殘留的消除規律具有一定的相關性，且其較容易合成和提取檢測的化合物，它可能是受試藥物、可能是受試藥物的一種代謝物或代謝物的結合物[20]。國際食品法典委員會(CAC)對慶大霉素豬、牛體內的殘留標示物研究報道[21]，慶大霉素的殘留標示物為母體藥物(parent drug)，也就是其原型藥。通過分析表明本試驗結果和CAC報道一致，因此，研究確定慶大霉素原型藥作為慶大霉素在羊體內的殘留標示物。

3.3 慶大霉素在羊體內殘留消除規律 對羊肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中慶大霉素的殘留消除特征及消除規律進行了研究。以8 mg/kg×體重的劑量連續給藥3 d后，按獸藥殘留取樣規范要求，選取7個時間點宰殺動物，測定四種組織中慶大霉素的殘留量。結果表明，四種組織中慶大霉素均有殘留且殘留濃度、消除速率不同，慶大霉素在脂肪中消除半衰期最短，肌肉中最長；給藥1 d后，腎臟殘留濃度最大，30 d后，四種組織中慶大霉素的殘留濃度已降至我國現行慶大霉素在其他動物(豬、牛)組織中最高殘留限量標準以下[13]。

3.4 慶大霉素在羊體內殘留靶組織的確定 肝臟一般是動物體主要的藥物代謝器官，對來自體內和體外的許多非營養性物質如各種藥物、毒物以及體內某些代謝產物具有“解毒”、生物轉化功能，來自血液或者其他組織的慶大霉素可能都需要經過肝臟的解毒功能；腎臟是形成尿液的器官，慶大霉素因通過腎臟排泄而蓄積，殘留濃度最高。尿液的形成和排出相比較肝臟的解排毒等功能生物周期短，因此，腎臟的消除半衰期比肝臟短。優先考慮靶組織的殘留濃度，結合慶大霉素具有腎毒性的毒性機理[22]，本研究確定腎臟作為慶大霉素在羊體內的殘留靶組織。

4 結 論

通過對慶大霉素在羊體內代謝和殘留消除規律研究，表明慶大霉素在羊體內不代謝，在腎臟中形成原尿隨尿液排出體外，腎臟可作為慶大霉素在羊體內的殘留靶組織，慶大霉素原型藥可作為殘留標示物。研究結果可為評價獸藥及其殘留物的安全性，制定最高殘留限量值，促進養殖業、食品加工業和貿易行業健康發展提供理論和技術支撐。