間隙連接蛋白37在腰椎椎間盤突出癥炎性反應中的意義

張琛琳，陳 思，陳劍峰，*

1.南京中醫藥大學研究生院，江蘇 210046

2.無錫市中醫醫院骨科，江蘇 214000

腰椎椎間盤突出癥是臨床上常見的腰部疾患，腰椎椎間盤纖維環在退行性變或外力的作用下出現裂隙，使得其包繞的髓核組織向后方突出，刺激、壓迫脊髓神經根，進而導致神經根出現炎癥、營養障礙，引起腰臀部及下肢的的酸麻疼痛，嚴重時還會影響患者日常活動，甚至出現二便失禁等馬尾神經癥狀。腰椎椎間盤突出癥的發生機制尚未明確，目前公認的機制主要有機械壓迫、化學性神經根炎、椎間盤自身免疫3種觀點［1］。近年來，隨著分子生物學的快速發展，基因多態性和基因突變與疾病發生的關聯受到關注。間隙性連接蛋白37（CX37）是一種可在細胞膜上形成間隙連接通道供細胞間直接信息交流的連接蛋白，它的異常與炎性反應介導的疾病相關［2］。本研究對10例腰椎椎間盤突出癥患者及8例腰椎爆裂骨折患者（椎間盤部分損壞，無明顯退變）的椎間盤進行影像學觀察、CX37和炎癥因子檢測，探討CX37在腰椎椎間盤突出癥炎性反應中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014—2016年本院收治的10例腰椎椎間盤突出癥手術患者作為觀察組。納入標準：①年齡20 ～ 75歲；②符合腰椎椎間盤突出癥的診斷標準［3］；③CT、MRI顯示腰椎椎間盤突出。排除標準：①合并其他嚴重的器質性病變，包括惡性腫瘤、骨折、腰椎滑脫等；②合并有心血管、肝、腎等系統嚴重原發性疾病；③精神疾病患者、治療不合作或同時進行其他治療者。選擇腰椎爆裂骨折且MRI顯示椎間盤無明顯退行性變的8例患者作為對照組。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。記錄患者的性別、年齡、體質量指數（BMI）、雙側大腿圍差值等基本信息。

1.2 影像學檢查

CT掃描層厚為3 mm，間距為1 mm，觀察患者椎間盤突出部位，分析是否有神經根受壓。患者仰臥位進行腰椎MRI檢查，攝橫斷面和矢狀面圖像，層厚為5 mm，評估患者脊髓是否存在變性。根據患者MRI T2加權像進行Pfirrmann分級［4］：Ⅰ級，椎間盤高度正常，組織信號均勻，髓核與纖維環分界清楚；Ⅱ級，椎間盤高度正常，椎間盤內稍有不均勻結構，髓核與纖維環分界清楚；Ⅲ級，椎間盤的高度與正常椎間盤相比輕度降低，椎間盤內有不均勻結構，信號欠均勻，纖維環與髓核分界不清；Ⅳ級，椎間盤的高度與正常椎間盤相比中度降低，椎間盤內有不均勻結構，椎間盤內有低信號，髓核與纖維環界限基本消失；Ⅴ級，椎間盤高度重度降低，椎間盤內有低信號與不均勻結構，髓核與纖維環界限消失，椎間盤塌陷。Pfirrmann分級由2名醫師獨立完成，將2名醫師的分析結果行Kappa一致性檢驗，意見不一致時由第3名醫師確定最終結果。

1.3 標本采集與檢測

觀察組患者通過椎間盤摘除術取出椎間盤組織，對照組患者通過減壓手術取出少量損傷椎間盤。將取出的髓核組織用生理鹽水沖洗后置于液氮集中保存。采用PCR方法檢測髓核組織中CX37、IL-6與TNF-α的mRNA表達水平。提取髓核組織中的RNA，反轉錄為cDNA，進行PCR擴增。引物序列：β-actin上游引物為5′-CACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物為5′-GTAGTCTGTCAGGTCCCG-3′；CX37上游引物為5′-CCTCCTCAGACCCTTACACGG-3′，下游引物為5′-CATCCCAGGCAGCCAGACT-3′；IL-6上游引物為5′-AAATCCCTCCTCGCCAATCT-3′，下游引物為5′-CCCTCACGGTCTTCTCCATAAA-3′；TNF-α上游引物為5′-ATCCGCGACGTGGAACTG-3′，下游引物為5′-ACCGCCTGGAGTTCTGGAA-3′。PCR 反應程序 ：94℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；最后72℃延伸7 min。反應產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以β-actin為內參計算各目的基因在mRNA水平的相對表達量。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析。實驗數據以x±s表示，采用兩樣本均數比較的t檢驗比較組間差異，以P ＜ 0.05認為差異有統計學意義。采用Pearson法分析CX37與IL-6、TNF-α表達的相關性。

2 結果

2組患者一般資料見表1。2組患者年齡、性別、BMI比較差異無統計學意義（P ＞ 0.05，表1）；觀察組雙下肢大腿圍差值明顯高于對照組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05，表1）。

2.2 影像學特征分析

CT顯示8例腰椎爆裂骨折患者均有不同程度的椎間盤損傷（圖1a）；10例腰椎椎間盤突出癥患者中，有4例出現髓核脫垂，5例出現髓核突出壓迫硬膜囊（圖1b），1例出現后緣銳角。MRI顯示8例腰椎爆裂骨折患者中，6例椎間盤損傷、硬膜囊完整，2例出現椎間盤向后突出、硬膜囊稍有受壓（圖1c）；10例腰椎椎間盤突出癥患者均可見椎間盤明顯突出（圖1d），有4例出現髓核脫垂，4例邊緣不規則，2例椎間盤有變性。經Pfirrmann分級，對照組Ⅰ級6例，Ⅱ級2例；觀察組Ⅲ級3例，Ⅳ級3例，Ⅴ級4例。

表1 一般資料Tab.1 General data

圖1 2組患者CT和MRIFig.1 CT and MRI imaging in 2 groups

2.3 髓核組織中CX37、IL-6和TNF-α mRNA的表達

PCR結果顯示觀察組CX37、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（P ＜ 0.05，圖2）。

圖2 髓核組織中CX37、IL-6和TNF-α mRNA相對表達量Fig.2 Relative expression quantity of CX37，IL-6 and TNF-α mRNA in nucleus pulposus

2.4 Pearson相關性分析

Pearson相關性分析顯示，炎癥因子IL-6，TNF-α與CX37均呈正相關（表2）。

表2 炎癥因子IL-6，TNF-α與CX37相關性Tab.2 Correlation between inflammatory factors IL-6，TNF-α and CX37

3 討 論

間隙連接蛋白（CX）是指相鄰細胞間的跨膜離子及低分子通道中組成連接子的功能一致的亞單位，其通過細胞間隙連接通訊（GJIC），將細胞質膜上的環狀連接子橫向移動到相鄰細胞的邊緣，并與相鄰細胞中的對應物對接，形成細胞間通道［5-7］。CX37是目前發現的20余種CX中的一種，通常在內皮細胞與巨噬細胞中表達［8］，前期在動脈粥樣硬化的研究中發現，CX37通過GJIC使得腺苷與內皮細胞和某些炎性細胞表面的受體結合而具有抗炎和細胞保護作用；CX37缺陷的單核細胞可減少腺苷的產生，促進小鼠的動脈粥樣硬化發生，有利于促炎性環境的形成［9-12］。Chanson等［2］認為CX37是炎性疾病的潛在修飾基因，巨噬細胞之間的間隙連接主要是基于電耦聯，通過染料轉移實驗驗證巨噬細胞與其他細胞的間隙連接時發現，CX37在單核細胞與巨噬細胞中存在染料轉移。至于CX37與腰椎椎間盤突出癥引起的炎性反應是否有關，本研究組前期的研究發現腰椎椎間盤突出癥的發生與CX37基因的CC基因型和C等位基因頻率（CC+CT）增高有關，提示CC+CT增高可能與突出的髓核物質中所含的內源性化學炎性介質有關［13］。

腰椎椎間盤突出癥中，發生退行性變的椎間盤往后突出，壓迫神經根與硬膜囊，局部產生神經根炎，從而導致局部炎性反應的發生。一方面，腰部炎性反應的產生將會不同程度地限制患側下肢活動，造成腰部及患側下肢肌肉退化，出現下肢肌肉控制能力的減退，長此以往會形成惡性循環，導致患側下肢肌肉進行性萎縮［14］；本研究發現觀察組患者的雙下肢大腿圍差值明顯大于對照組，證實了腰椎椎間盤突出癥患者會出現不同程度的患側下肢肌肉萎縮。另一方面，McCarron等［15］研究發現，突出物邊緣區域是以新生血管形成和巨噬細胞浸潤為主的肉芽組織，病灶附近常存在充血、炎性反應，突出的髓核中所含的內源性化學物質會引起炎性反應，并且存在以巨噬細胞為主的炎性細胞浸潤。本研究發現，CT、MRI影像結果顯示2組患者椎間盤及脊髓的形態存在差異，部分椎間盤突出癥患者的髓核突出，壓迫硬膜囊，且對照組患者椎間盤Pfirrmann分級為Ⅰ或Ⅱ級，觀察組患者椎間盤Pfirrmann分級為Ⅲ～Ⅴ級，說明腰椎椎間盤突出癥患者椎間盤均發生明顯的退行性變，壓迫硬膜囊導致炎性反應的產生。

Mochida等［16］研究認為，正常椎間盤中不存在巨噬細胞，當椎間盤組織突出暴露于硬膜外后，可將血管撕破，刺激新生血管中的單核細胞轉變為巨噬細胞長入突出組織內進行吞噬。巨噬細胞分泌某些生物活性物質，如IL-1、IL-6、TNF等也參與調節免疫應答，并且有著明顯的致痛覺過敏作用。張威林等［17］亦認為炎性成分可導致椎間盤發生退行性變，其中IL-6、TNF等炎癥因子的表達在椎間盤退行性變過程中顯著增高。

TNF-α是最早出現且最重要的炎性因子，能激活中性粒細胞及淋巴細胞從而參與炎性反應；IL-6主要由T細胞、血管內皮細胞及單核/巨噬細胞等產生，其通過影響細胞外基質蛋白多糖、膠原及機體免疫應答促進炎性反應的發生［18］。本研究發現觀察組髓核組織中IL-6與TNF-α水平明顯高于對照組，表明確有炎性反應的發生。同時CX37水平也明顯高于對照組，且與炎癥因子IL-6，TNF-α呈正相關。分析其原因可能是，在炎性反應過程中隨著巨噬細胞的釋放，CX37的表達明顯增高［2］，而巨噬細胞同時會分泌IL-6、TNF-α等炎性因子共同參與炎性反應；CX37可能通過GJIC使得巨噬細胞與某些炎性細胞表面的受體結合而使炎性反應加劇。

綜上所述，CX37可能通過GJIC調控炎性因子參與腰椎椎間盤突出癥炎性反應的發生、發展。但本研究樣本量較小，本課題組正在進一步收集資料，將擴大樣本量進行后續研究，探索CX37與腰椎椎間盤突出癥炎性反應之間的具體機制，為腰椎椎間盤突出癥的機制研究及臨床診治提供依據。