臺灣青棗果實過氧化物酶部分酶學特性分析

鄭楚珊 詹嘉紅

摘 要：過氧化物酶（POD）是參與酚類物質氧化，并且在果蔬酶促褐變中發揮著重要作用的主要酶類之一。該研究以臺灣青棗果實為材料，以愈創木酚為底物，采用分光光度法對該果實POD部分酶學特性進行研究。結果表明，臺灣青棗果實POD的最適pH值為5.8，最適溫度為40℃。pH值小于3.0時酶基本失活，溫度高于70℃時也基本失活。該酶熱穩定性較差，100℃處理超過15s時，酶幾乎鈍化。抗壞血酸和NaHSO對POD有明顯的抑制作用，而EDTA的抑制作用較弱。3種化合物的抑制效果依次是抗壞血酸>NaHSO3>EDTA。

關鍵詞：臺灣青棗；過氧化物酶；酶學特性

中圖分類號 Q554 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）14-0025-04

Partial Characteristic of Peroxidase in Indian Jujube Fruits

Zheng Chushan1 et al.

（1Shantou No. 4 Middle School，Shantou 515041 China）

Abstract：Peroxidase（POD） is one of the major oxidases involving in the oxidation of phenolics and plays important roles in enzymatic browning of fruits and vegetables. With spectrophotometry method and based on substrate of guaiacol，the enzymatic characteristics of peroxidase（POD） from Indian jujube fruits were studied. Results showed that the optimum pH and temperature of POD were 5.8 and 40℃. At the pH value of less than 3.0 and the temperature higher than 70℃ were basically undetectable activity. The POD had poor thermal stability，its activity was completely passivated when it was incubated at 100℃ and dealing with more than 15s. Ascorbic acid and NaHSO3 had great inhabitation effect on POD，and EDTA was weaker. Their inhibitory capacity was decreased in the order：ascorbic acid>NaHSO3 >EDTA.

Key words：Indian jujube（Ziziphus mauritiana Lamk.）；Peroxidase；Enzymatic characteristic

臺灣青棗（Ziziphus mauritiana Lamk.），又稱毛葉棗、印度棗、滇刺棗、西西果等，屬鼠李科棗屬植物[1]。臺灣青棗是我國從臺灣引進的熱帶亞熱帶特色水果，果實營養豐富，富含維生素、礦物質、膳食纖維及大量黃酮類化合物，尤其是VC含量，每100g臺灣青棗果肉VC是蘋果的56倍[2]，比號稱“VC之王”的中華獼猴桃（47～255mg/100g）含量還高[3，4]，因而，有“熱帶小蘋果”、“天然維生素丸”的美稱。臺灣青棗以其果大，核細，甜度適中，口味獨特，并具有較高的藥用價值和保健作用，如健脾強身、清涼解毒、鎮靜安神等功效[5]，越來越受到消費者的喜愛。但臺灣青棗果實較不耐貯藏，鮮果在常溫下極易失水皺縮、變黃、變褐和腐爛，嚴重影響其商品價值和食用品質[6]，其中，酶促褐變是臺灣青棗品質下降的一個重要原因。

過氧化物酶（peroxidase，簡稱POD）是果蔬中普遍存在的一類氧化還原酶，是果蔬成熟和衰老的生理指標[7]，研究表明過氧化物酶參與了果蔬的酶促褐變[8-10]。近年來對臺灣青棗果實采后保鮮研究多集中在生長調節劑[11，12]、涂膜[13]和CaCl2[14]處理等方面，而對其與褐變關系密切相關的過氧化物酶特性研究則鮮見報道。為此，本試驗擬以臺灣青棗果實為原料，對其過氧化物酶部分酶學性質進行研究，為了解臺灣青棗果實采后褐變原因及制定防褐措施提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 試驗材料為無損傷、無病蟲害、成熟度為70%～80%成的臺灣青棗蜜棗品種，購自當地果場。

1.2 試劑及儀器 愈創木酚、30%過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、抗壞血酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、亞硫酸氫鈉等，以上試劑均為分析純。UV2100型紫外可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠）；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市友聯儀器研究所）；PHS-2C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）等。

1.3 方法

1.3.1 POD的提取 稱取臺灣青棗果肉5g，加入10mL預冷0.05mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液，低溫研磨至勻漿，并定容至25ml后，低溫離心（10000r/min，20min），上清液即為酶的粗提液，低溫保存備用。

1.3.2 POD活性測定[15] 采用愈創木酚法，反應體系：0.05mol/L pH6.0磷酸緩沖液2.5mL+0.05mol/L愈創木酚1.5mL+1% H2O2 0.5mL+0.5mL酶液。于室溫下測定波長470nm的OD值，對照以緩沖液代替酶液，結果以POD的相對酶活（%）表示。

1.3.3 POD最佳反應時間的確定 按1.3.2的測定方法，總反應體系分別反應0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5min，測其OD值。

1.3.4 POD最適pH的測定 用不同pH（范圍2.2～8.0）磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液取代反應體系中的磷酸鹽緩沖液，按1.3.2的測定方法，在室溫下測定不同pH值下的OD值。

1.3.5 POD最適溫度的測定 按1.3.2測定方法取樣，在先不加酶液的情況下，最適pH緩沖液和反應底物分別在不同溫度（10～70℃）條件下保溫15min后，加入酶液繼續在原溫度下保溫1min，于室溫下測定不同溫度條件下的OD值。

1.3.6 POD熱穩定性的測定 取等量酶液若干份，置100℃水浴中加熱處理，按一定時間間隔取出后，迅速冷卻，按1.3.2的測定方法，于室溫下測定不同熱處理時間的OD值。

1.3.7 化合物對POD活性影響的測定 按1.3.2測定方法取樣，向反應體系分別加入一定濃度的化合物，使化合物的最終濃度分別是：NaHSO3為0、5、10、15、20、25g/L；抗壞血酸為0、25、50、75、100、125mg/L；EDTA–2Na為0、3、6、9、12、15、18g/L，在最適溫度、最適pH下測定不同濃度化合物的OD值。

2 結果與分析

2.1 POD的最佳反應時間 由圖1可知，在酶促反應進程中，隨著反應的進行，反應速率會逐漸降低，因隨著反應時間的延長，底物濃度會減少、產物濃度會增加、酶活性會下降。因此為消除干擾因素，酶促反應速率是以初速率表示[16]。由圖可知，在反應初期的前2min內，隨著反應的進行，OD值幾乎成直線上升，即在這一時間段，酶促反應速率基本保持不變。因此本實驗確定的酶促反應時間以不超過2min為宜。

2.2 pH對POD活性的影響 環境pH值是影響酶活性的重要因素之一，每種酶只能在一定的pH范圍內才表現出活性，而在這個范圍內，酶活性常隨著環境pH的改變而改變。由圖2可知，該酶的最適pH值為5.8，pH值在5.0～7.4，酶均表現出較高活性，相對活性在80%以上。由于過酸或過堿的環境會使酶變性失活，當pH值從5.8降至4.2或升至8.0時，酶活性均迅速下降，相對殘留活性降至46%，當pH低于3.0時，酶接近失活。因此，在臺灣青棗的貯運保鮮或加工過程中，適當降低pH值可作為抑制褐變發生的有效措施，如通過添加食用酸等方法可一定程度抑制該酶的活性。

2.3 溫度對POD活性的影響 溫度對酶活性的影響具有雙重性。在較低溫度范圍內，酶活性隨著溫度的升高而升高，但當溫度超過最適溫度后，隨著溫度的升高酶活性反而降低。溫度對臺灣青棗POD活性的影響如圖3。由圖3可知，該酶的最適溫度為40℃，在25～50℃范圍，該酶保持著較高活性，相對活性均在75%以上，而當溫度為10℃時，POD相對活性僅有24.4%，當溫度超過50℃時，隨著溫度的升高，酶活性迅速下降，當溫度達到70℃時，酶基本失活。因此，對臺灣青棗的保鮮防褐，鮮果可采用低溫冷藏的方法來進行，而對加工食品則可通過適當的熱處理來達到。

2.4 POD的熱穩定性 由圖4可知，在處理的前7s內，酶殘留活性仍保持在80%以上，當處理時間超過7s后，酶活性迅速下降，處理時間達到13s時，殘留活性不到20%，當處理時間超過15s時，酶活性幾乎鈍化。因此，臺灣青棗的加工產品可通過瞬間高溫處理來達到抑制褐變的目的。

2.5 化合物對POD活性的影響 由圖5、圖6和圖7可知，3種化合物及其濃度對臺灣青棗POD活性均有不同程度的抑制作用。當NaHSO3濃度在0～15g/L，隨著濃度的增加，POD活性逐漸下降，當濃度超過15g/L時，酶活性降低更加明顯，當濃度為25g/L時，酶活性受抑制程度達到94.6%。抗壞血酸濃度在0～50mg/L，隨著濃度的增加，POD活性迅速下降，當抗壞血酸濃度為75mg/L時，殘留活性僅為15%，當濃度升至125mg/L時，POD活性幾乎被完全抑制。相比上面2種抑制劑，EDTA對POD活性抑制程度較低，當EDTA濃度在0～6.0g/L，隨著濃度的增加，酶活性逐漸降低，但當EDTA濃度達到6.0g/L及以上時，酶活性基本趨于穩定，并一直保持在相對酶活60%左右。

根據上面試驗結果，以較低抑制劑濃度呈現出最佳抑制效應分析，抗壞血酸的抑制效果最佳，其次是NaHSO3，EDTA抑制程度最低。

3 結論

實驗結果顯示：臺灣青棗果實POD的最適pH值為5.8，當pH值在5.0～7.4，相對酶活保持在80%以上，當pH值低于3.0時，酶接近失活；臺灣青棗果實POD的最適溫度為40℃，低于20℃或高于50℃時，酶活性均明顯下降；該酶熱穩定性較差，當處理時間超過15s時，酶活性幾乎鈍化。

3種抑制劑對臺灣青棗POD活性的抑制效果依次是：抗壞血酸>NaHSO3>EDTA。其中，抗壞血酸和NaHSO3對POD活性的抑制存在明顯的劑量效應，當抗壞血酸濃度為125mg/L、NaHSO3濃度為25g/L時，臺灣青棗果實POD活性幾乎被完全抑制。考慮到食品的安全性，NaHSO3在食品中的添加應執行嚴格的限量。相比之下，抗壞血酸屬天然抗氧化劑，安全性高、抑制效果好，因此，在實際應用中，可把抗壞血酸作為臺灣青棗果實POD的理想抑制劑。

參考文獻

[1]張義勇.臺灣青棗、火龍果北方日光溫室栽培技術[M].北京：中國農業出版社，2005：74-76.

[2]徐小艷，吳錦鑄.臺灣青棗的營養成分分析與利用[J].食品科技，2009，34（10）：32-34.

[3]任繼海.棗樹管理與紅棗儲藏加工[M].北京：中國科學技術出版社，1998：58

[4]劉長明，王曉亮，陳美元.棗貯藏保鮮研究簡述[J].煙臺果樹，2010，（3）：6-7.

[5]陳蓮，林河通，陳藝暉，等.臺灣青棗果實采后處理與保鮮技術研究進展[J].包裝與食品機械，2010，28（2）：9-13，59.

[6]陳蓮，林河通，王璐璐，等.安喜布處理對采后臺灣青棗果實的保鮮效應[J].中國食品學報，2014，14（12）：113-120.

[7]丁薪源，曹健康.果蔬過氧化物酶酶學特性研究進展[J].食品科技，2012，（10）：62-66.

[8]白永亮，余銘，袁根良，等.大蕉后熟期的褐變相關性及褐變底物鑒定[J].食品科學，2012，33（04）：271-275.

[9]馮立娟，尹燕雷，楊雪梅，等.石榴果實發育期果皮褐變及相關酶活性變化[J]. 核農學報，2017，31（4）：0821-0827.

[10]康娟，莊尹宏，林碧英，等.絲瓜多酚氧化酶及過氧化物酶酶學特性的研究[J].福建農業學報，2017，32（8）：854-858.

[11]陳蓮，王璐璐，林河通，等.1-MCP 延緩采后臺灣青棗果實衰老及其與能量代謝的關系[J].熱帶作物學報，2017，38（1）：175-182.

[12]Bandopadhyay A，Sen S K. Studies on the Physicochemical Changes Associated with Storage Life of Bercv. Gola[J].Indian Agriculturist，1995，39：67-70.

[13]吉建邦，康效寧，謝輝.毛葉棗貯藏適性研究[J].食品工業科技，2003，24（10）：135-137.

[14]汪躍華，林銀鳳，溫玉輝.氯化鈣結合低溫處理對臺灣青棗貯藏的影響[J].西南農業大學學報（自然科學版），2006，28（2）：195-196，212.

[15]詹嘉紅.楊桃果實過氧化物酶特性及其抑制條件研究[J].熱帶作物學報，2016，37（8）：1489-1493.

[16]王冬梅，呂淑霞.生物化學[M].北京：科學出版社，2010：95.

（責編：張宏民）