黑豆醬油的開發及其品質分析

王 鵬，王文平*，續丹丹，張 欣，馬翛然，張 建，高麗華，崔金梅，鄭晨曦

（1.北京食品科學研究院，北京 100068；2.北京市食品釀造研究所，北京 100050；3.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

醬油起源于中國，有超過2 000年的歷史[1]。醬油是以大豆、豆粕、小麥、麩皮、水、鹽等作為原料，通過米曲霉制曲發酵，后期添加鹽水自然發酵或乳酸菌和酵母菌厭氧發酵制得[2-3]。在多種微生物的共同作用下，醬油產生了獨特的風味和滋味物質，如酯類、醇類、醛酮類、游離氨基酸、多肽以及美拉德產物等。它以獨特的風味和咸鮮味在亞洲國家盛行，是人們日常飲食中必備的調味品。

我國醬油以工藝劃分可以分為高鹽稀態發酵、低鹽固態發酵和原池澆淋發酵，目前我國醬油企業的工藝多以前兩種發酵工藝為主。高鹽稀態發酵工藝具有發酵時間長，醬醅鹽分含量高（18%～20%），水分比例大（鹽水∶原料=2.0～2.5）等特點，這種工藝生產的醬油通常由于耐鹽微生物及較長的發酵周期，其原料發酵更徹底，產生的醬油色澤較淺，風味物質更豐富，通常具有較好的風味[4-5]；低鹽固態發酵工藝發酵時間短，醬醅含鹽量低（6%～7%），水分含量低（鹽水∶原料=1∶1），生產效率高，成本低，產出的醬油色澤較深且酯香味不足[6]；原池澆淋技術是在低鹽固態發酵工藝的基礎上進行改進，含鹽量通常為14%左右，醬醅含水量在57%左右，采用先固后稀工藝，通過回流方式對發酵底物澆淋，充分利用酶活以提高原料的利用率和氨基酸的生產率，其發酵周期較短，產出的醬油色澤光亮，通過在發酵前期或者中期加入酵母菌和乳酸菌，能明顯改善產品風味質量[7-8]。

黑豆營養價值豐富，蛋白質含量高達40 g/100 g，富含鈣、硒、鋅、鎂、磷等多種微量元素及維生素[9]，其表皮中富含的原花青素（3.61%～5.59%）被認為是目前研究發現的一種高效的自由基清除劑，具有保護心血管系統、降血糖、抗腫瘤等作用[10-11]。金衛東等[12]采用低鹽固態發酵工藝生產黑豆醬油，并對其理化、氨基酸、脂肪酸等指標進行分析，得出其含量明顯高于普通醬油。潘麗梅等[13]對黑豆醬油制曲過程的影響因素進行了優化，獲得了最優的制曲工藝。張歡歡等[14]對黑豆、黃豆兩種蛋白原料制備的高鹽稀態醬油的理化、抗氧化、風味組成等指標進行了分析，發現黑豆醬油抗氧化活性高于黃豆醬油，黃豆醬油醇香突出，黑豆醬油中醇、酯及醛酮類主要揮發性成分較均衡，風味協調。

本研究以黑豆為原料，采用原池澆淋發酵工藝制備黑豆醬油，分析其產品感官、理化及微生物指標，并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用儀（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和全自動氨基酸分析儀分析了醬油中的香氣物質組成和氨基酸組成，為黑豆的深度開發和黑豆醬油的產業化生產提供一定的實驗基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

某品牌黃豆醬油（特級醬油）、黑豆、面粉、食鹽：北京某市場；米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951（滬釀3.042）和生香酵母FA-1：北京市食品釀造研究所提供。

1.1.2 化學試劑

3-辛醇、原花青素、大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素、果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖（純度均≥99%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉、甲醛、正丁醇、硫酸鐵銨乙酸、酚酞、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純），甲醇、乙腈（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

乳糖膽鹽發酵培養基、金黃色葡萄球菌顯色培養基、沙門氏菌顯色培養基、平板計數瓊脂培養基：北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

5975-7890A氣相色譜質譜儀（配安捷倫GC多模式自動進樣器）、LC1260液相色譜儀：美國安捷倫公司；65 μm PDMS/DVB萃取頭：美國Supelco有限公司；L-8900氨基酸自動分析儀：日本日立公司；DHG-9051A電熱恒溫干燥箱、DHP-9051B微生物培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；福斯KJELTEC 2300凱氏定氮儀：美國FOSS公司；722型數顯可見分光光度計：上海光學儀器五廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆醬油加工工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）原料處理：精選豆粒飽滿、碩大的黑豆，去除雜質。將黑豆加入清水中，黑豆與清水質量比為1∶3，浸泡6 h后，撈出淋干。將控好水的黑豆放入蒸鍋中，壓力0.1 MPa條件下蒸料40 min；面粉炒制15 min。將蒸煮好的黑豆放入冷卻槽中冷卻降溫，溫度降至60℃時，與炒制面粉混合均勻，繼續自然冷卻。

（2）制曲：當物料冷卻至33℃時，按接種量0.03%接種米曲霉AS3.951并混合均勻，入制曲盤，溫度控制在32～34℃，14～16h翻曲一次，培養42h出曲。所制得的曲料呈黃綠色，表面有孢子，中性蛋白酶活力為800～1 000 U/g。

（3）酵母醪制備：將小麥用對輥式粉碎機破碎至3～4瓣，加溫水潤料1 h，0.1 MPa條件下蒸煮30 min，出鍋冷卻至31℃。接入質量分數為0.03%的AS3.951米曲霉，制小麥曲培養26～28 h。出曲拌15°Bé的鹽水，鹽水與大曲的質量比為2∶1。48℃培養5 d，待麥醪溫度降至38～40℃時添加生香酵母FA-1培養液（106個/mL）培養3 d，即得酵母醪。

（4）發酵：每個46℃發酵罐中加入10 kg曲料，50℃的14 °Bé鹽水，鹽水和曲料的質量比為0.72∶1，進行發酵，每天澆淋一次，發酵8 d，得前酵產物。向發酵罐中前酵產物補加45℃的18°Bé鹽水15 kg，每天澆淋一次。發酵10 d后，加入500 mL酵母醪，發酵溫度改為42℃，發酵40 d左右，即得黑豆醬油。

1.3.3 分析檢測

黑豆醬油感官指標及理化指標（氨基酸態氮、全氮、可溶性無鹽固形物）按照國標GB 18186—2000《釀造醬油》中的方法測定；微生物指標根據國標GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》中的方法測定。

按照國標GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》測定游離氨基酸含量；大豆異黃酮含量測定參照GB/T 26625—2011《大豆異黃酮含量測定》中的高效液相色譜法；原花青素含量測定參照《保健食品檢驗與評價技術規范》中的方法；還原糖含量測定參照國標GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》。

1.3.4 黑豆醬油揮發性風味物質分析

樣品前處理：稱取2.0g黑豆醬油樣品于20mL萃取瓶中，加入0.5g氯化鈉調節離子強度，吸取內標物100μg/mL 3-辛醇溶液10 μL。在50℃條件下振蕩40 min，然后萃取40 min。萃取后于氣相色譜儀進樣口解吸5 min，進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，采用不分流模式進樣；進樣口溫度250℃。程序升溫程序：40℃保持3 min，以5℃/min的速度升至100℃，然后以6℃/min的速度升至220℃并保持10 min。

質譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，掃描模式為全掃描，掃描范圍35～400 amu。

定性定量方法：化合物組成的分析以美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）08譜庫檢索結果進行確定，保留匹配度＞750的組分；采用內標法（質量濃度100 μg/mL 3-辛醇溶液10 μL）計算各組分的含量。

2 結果與分析

2.1 黑豆醬油的感官指標

表1 兩種醬油感官指標結果Table 1 Results of sensory indexes of two kinds of soy sauce

由表1可知，與某品牌黃豆醬油比較，黑豆醬油色澤更厚重，呈黑褐色，醬香濃郁，味道鮮美，狀態澄清、無懸浮物和雜質。結果表明，黑豆醬油的感官指標達到相關國標特級醬油標準。

2.2 黑豆醬油的理化指標

表2 兩種醬油理化指標測定結果Table 2 Results of physiochemical indexes of two kinds of soy sauce

由表2可知，黑豆醬油中可溶性無鹽固形物、全氮、氨基酸態氮含量分別為16.62 g/100 mL、1.53 g/100 mL、0.85 g/100 mL，均高于某品牌黃豆醬油，并且達到特級醬油國標要求。

大豆異黃酮是豆制品中一種天然植物雌激素，具有預防心血管疾病、骨質疏松及更年期綜合征等多種生物活性作用[15]。兩種醬油中大豆異黃酮含量分別為6.82 mg/100 g和6.62 mg/100 g，兩者相差不大，其中染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素含量在1.16～2.08 mg/100 g范圍。黑豆醬油中果糖（0.5%），黃豆醬油中葡萄糖（1.0%）。原花青素具有很強的抗氧化活性，具有保護心血管系統、抗腫瘤、降血糖、延緩皮膚衰老等作用[16]。黑豆醬油中原花青素含量為24.2 mg/100 g，這賦予了黑豆醬油一定的保健功效。

2.3 黑豆醬油的微生物指標

表3 兩種醬油微生物指標結果Table 3 Results of microbial indexes of two kinds of soy sauce

由表3可知，兩種醬油中菌落總數均＜10 CFU/mL，大腸菌群＜30 MPN/100 mL，致病菌沙門氏菌均未檢出，金黃色葡萄球菌檢驗結果為＜10 CFU/mL，結果表明，黑豆醬油微生物指標滿足相關國標要求。

2.4 醬油的風味成分分析

采用氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）對兩種醬油中的香氣成分進行分析，結果見表4。由表4可知，兩種醬油共有92種風味化合物檢出，黑豆醬油和黃豆醬油中鑒定出的風味化合物分別為75和77種，其中黑豆醬油中的風味組成包括吡嗪類（8種）、醇類（8種）、酚類（5種）、含硫化合物（7種）、醛類（10種）、酸類（7種）、酮類（6種）、酯類（17種）、其他類（7種）。兩種醬油中醇類化合物含量最高，醛類、酸類及酯類次之，這些化合物為醬油獨特的風味貢獻了極其重要的作用。

醇類物質在醬油風味化合物中含量最高，兩種醬油中均鑒定出8種醇類化合物，黑豆醬油中總含量為740.54μg/kg，以乙醇和苯乙醇為主，這與張艷芳等[17]的研究結果類似。醇類通常具有令人愉快的甜香味，主要是在發酵過程中由微生物代謝，不飽和脂肪酸降解以及羰基化合物的還原反應生成的[18]。黑豆醬油中苯乙醇含量為334.76 μg/kg，遠高于黃豆醬油中其含量（64.89 μg/kg）。苯乙醇具有玫瑰花香味，是醬油中的關鍵風味化合物[19]，是醬醪在發酵過程中由苯丙氨酸降解產生的[20-21]。

表4 兩種醬油中揮發性化合物GC-MS分析結果Table 4 Results of volatile compounds in two kinds of soy sauce analysis by GC-MS

續表

續表

酸類化合物在醬油中的主要貢獻是對醬油香氣具有一定的緩和作用[22]，并在發酵過程中與醇類發生酯化反應。酸類可能是由微生物產生的脂肪酶對大豆油脂降解所產生，低分子質量脂肪酸也可能通過酵母或乳酸菌代謝生成[23]。黑豆醬油中共檢出7種酸，總含量達到148.46 μg/kg，其中2-甲基丁酸、3-甲基丁酸及乙酸的含量分別為66.74μg/kg、50.68 μg/kg和12.85 μg/kg。

黑豆醬油和黃豆醬油中含硫化合物含量分別為108.84μg/kg和64.89μg/kg，對醬油的風味起著重要的作用，它們多存在于釀造產品中，是由含硫蛋白質酶解產生[24]。黑豆醬油中3-甲硫代丙醇含量很高，為36.76 μg/kg，占含硫化合物總含量的30%左右，其在較低濃度時呈現較為強烈的烤肉香氣[25]。

兩種醬油中的酯類化合物種類最多，黑豆醬油中共鑒定出17種酯類化合物，總含量為121.01 μg/kg。醬油中的酯類化合物主要以短鏈乙酯為主[25]，通常具有較強的揮發性，具有更小的香氣閾值且多呈果香味[26]，如乙酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、丁二酸二乙酯等，它們主要是通過酵母菌對大豆油脂作用產生醇類和酸類酯化反應得到[27]，其中乙酸乙酯含量最高，為24.27 μg/kg；苯乙酸乙酯其次，為18.92 μg/kg，具有濃烈而甜的蜂蜜香氣[28]。長鏈脂肪酸酯中含量較高的是十六烷酸乙酯，含量為8.21 μg/kg。

黑豆醬油中醛類化合物含量僅次于醇類，為224.48μg/kg，共鑒定出11種，以2-甲基丁醛（44.61 μg/kg）和苯乙醛（39.61 μg/kg）為主。低分子質量醛主要是由氨基酸降解和微生物轉化形成的，如2-甲基丁醛、苯乙醛、可卡醛、3-甲基丁醛以及苯甲醛等[29]。吡嗪類化合物也是醬油風味的重要組成部分，主要是通過蛋白質以及氨基酸的熱分解或美拉德反應形成。2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪以及四甲基吡嗪都能為醬油提供烤可可和堅果的香氣[25]。黑豆醬油中檢出8種吡嗪類化合物，總含量為98.14 μg/kg，其中4-甲基吡嗪含量最高，達到39.26 μg/kg。

黑豆醬油中酚類物質含量為137.04 μg/kg，且有5種酚類被檢出，其中4-乙基愈創木酚在兩種醬油中均被檢出，酚類主要是在發酵過程中通過曲霉的降解作用產生。

2.5 醬油的游離氨基酸組成

對兩種醬油中游離氨基酸組成進行分析，結果見表5。

表5 兩種醬油樣品中游離氨基酸檢測結果Table 5 Determination results of free amino acids in two kinds of soy sauce

由表5可知，黑豆醬油和黃豆醬油中均分別檢出17種游離氨基酸（含7種必需氨基酸），對醬油滋味影響較大[30]。黑豆醬油游離氨基酸總量為37 749.61 μg/mL（其中必需氨基酸含量為16793.43μg/mL），而黃豆醬油中游離氨基酸總量為43 517.95μg/mL（必需氨基酸含量為19 063.49μg/mL）。黑豆醬油中鮮味氨基酸含量為9 471.03μg/mL，苦味氨基酸含量為17383.25μg/mL，甜味氨基酸含量（10 839.1μg/mL），酸味氨基酸含量（56.23μg/mL）。黑豆醬油因其游離氨基酸含量較高，且含有人體所需的必需氨基酸，因此具有較高的營養保健價值。

3 結論

利用蛋白質含量較高的黑豆為原料，按照原池澆淋發酵工藝制備黑豆醬油，對其感官、理化、微生物指標進行了分析，結果表明，黑豆醬油呈黑褐色、醬香濃郁、味道鮮美，其可溶性無鹽固形物、全氮、氨基酸態氮含量分別為16.62g/100mL、1.53g/100mL、0.85g/100mL，達到相關國標特級醬油的要求。黑豆醬油大豆異黃酮含量為6.82mg/100g，原花青素含量為24.2 mg/100 g。黑豆醬油中共鑒定出75種風味化合物，以醇類（740.54 μg/kg）、醛類（230.90 μg/kg）、酯類（121.01μg/kg）為主，共檢測出游離氨基酸17種（含7種必需氨基酸），總量為37 749.61 μg/mL（其中必需氨基酸含量為16 793.43 μg/mL）。該工藝制備黑豆醬油生產周期短、風味豐滿，具有營養保健功效及良好開發應用前景。