谷氨酸清潔發酵工藝研究

戶紅通，徐 達，徐慶陽，2，3*，陳 寧，2，3

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457）

現有谷氨酸發酵的主要問題是發酵液色澤深、黏度大、雜質多，造成起泡嚴重、溶解氧不足、傳質困難、發酵過程不穩定[1]。其中的主要原因是發酵培養基中添加大量的玉米漿和豆粕水解液這類色素深、雜質多的發酵氮源，同時對于“生物素亞適量型”谷氨酸發酵，玉米漿中生物素的波動也造成了發酵的不穩定。

谷氨酸發酵的氮源主要來源于玉米漿和豆粕水解液，玉米漿和豆粕水解液含有豐富的有機氮源、多種維生素及促進菌體生長的微量元素等多種生長因子，能夠促進菌體的快速生長并維持較高的菌體酶活力[2]。但在谷氨酸的發酵過程中并不能大量添加玉米漿，主要原因是玉米漿中含有較多的生物素，對于“生物素亞適量型”谷氨酸生產菌而言，過多的生物素會限制菌體細胞膜的通透性，使得谷氨酸非生產菌向谷氨酸生產菌的轉變不完全，發酵產酸較低[3-4]。另外，玉米漿和豆粕水解液中含有大量的色素，尤其是玉米漿中還有大量的不可被菌體利用的蛋白質、少量的淀粉、纖維素以及不可被菌體利用的有毒有害物質[5-7]。這些物質的大量存在，不但引起發酵液黏度大、易起泡、溶氧效率低、攪拌功率低以及生物素含量不穩定等問題，同時引起發酵過程難于控制、發酵不穩定，而且還進一步給后續的谷氨酸發酵提取帶來困難，增加了生產成本[8]。因此，需要對谷氨酸發酵培養基進行調整，尋找雜質、色素等較少且營養豐富的有機氮源，對玉米漿和豆粕水解液進行替代是主要的解決方法[9]。

本研究在對玉米漿和豆粕水解液主要成分充分了解的基礎上，進行了發酵氮源的近似等效替代。首先使用生物氮素（含有豐富的氨基酸、蛋白質及小分子肽等）作為氮源，維生素B1（vitamin B1，VB1）作為生長因子，生物素使用定量配制的溶液添加，由于所使用的谷氨酸生產菌是甲硫氨酸缺陷型菌株[10]，故另外添加一定量的甲硫氨酸，其他培養基成分維持不變，采用單因素及正交試驗法，確定了清潔培養基的最佳配比，最終得到谷氨酸清潔發酵培養基。清潔發酵培養基與對照發酵培養基相比，其最大的優點在于大大減少了玉米漿和豆粕水解液中的大量雜質、色素以及毒害物質，所得的發酵液澄清度大大增加，黏度降低，泡沫少，使得發酵液溶氧效率得到提高，攪拌功率降低，發酵過程更加容易控制，生物素的定量添加使得發酵產酸更加穩定，轉化率和產酸量也得到了提高。本研究的目的在于獲得相對清潔的發酵培養基，減少雜質含量、提高發酵液質量和提高發酵穩定性，最終也相應地提高了發酵產酸和糖酸轉化率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

生物素亞適量型黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）GDK-168：由天津科技大學代謝工程研究室保藏。

1.1.2 試劑

生物氮素（總氮≥11.0%，氨基酸態氮≥3.0%，水分≤7.0%，灰分≤10.0%）：麥迪爾生物科技江蘇有限公司；葡萄糖、Na2HPO4、MgSO4、KCl、VB1、VH（生物素）、MnSO4、FeSO4、甲硫氨酸、豆粕水解液、玉米漿：國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

對照發酵培養基：葡萄糖80g/L，Na2HPO4·12H2O2.83g/L，MgSO4·7H2O 1.83g/L，KCl 1.33g/L，MnSO4·H2O 2.33 mg/L，VB10.233 mg/L，FeSO4·7H2O 2.33 mg/L，糖蜜1.1 g/L，豆粕水解液10 mL/L，玉米漿4 mL/L。121℃高壓滅菌15 min。

清潔發酵培養基：葡萄糖80g/L，Na2HPO4·12H2O2.83g/L，MgSO4·7 H2O 1.85 g/L，KCl 1.5 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，FeSO4·7H2O 2.5 mg/L，生物氮素、VB1、VH（生物素）及甲硫氨酸。121℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療機械廠；MCGS 5 L不銹鋼機械攪拌發酵罐、MCGS 30 L不銹鋼機械攪拌發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；A300氨基酸分析儀：德國安米諾西斯公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗優化培養基組分

（1）生物氮素對谷氨酸發酵的影響

維持部分對照谷氨酸發酵培養基成分（葡萄糖80 g/L，Na2HPO4·12H2O2.83g/L，KCl1.33g/L，MnSO4·H2O2.33mg/L，FeSO4·7H2O 2.33mg/L，MgSO4·7H2O 1.83g/L）不變（下同），在生物素5 μg/L、VB16 mg/L、甲硫氨酸1.0 g/L的條件下，考察不同生物氮素添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）對谷氨酸發酵的影響。

（2）生物素對谷氨酸發酵的影響

在生物氮素最佳添加量、VB16 mg/L、甲硫氨酸1.0g/L的條件下，考察不同生物素添加量（3 μg/L、5 μg/L、7 μg/L、9 μg/L、11 μg/L）對谷氨酸發酵的影響。

（3）VB1對谷氨酸發酵的影響

在最佳生物氮素添加量、最佳生物素添加量、甲硫氨酸1.0 g/L的條件下，考察不同VB1添加量（2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L）對谷氨酸發酵的影響。

（4）甲硫氨酸對谷氨酸發酵的影響

在最佳生物氮素添加量、最佳生物素添加量、最佳VB1添加量的條件下，考察不同甲硫氨酸添加量（0.4g/L、0.6g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L）對谷氨酸發酵的影響。

1.3.2 正交試驗優化培養基組分

在單因素試驗的基礎上，以生物氮素（A）、生物素（B）、VB1（C）和甲硫氨酸（D）添加量為研究因素，以OD600nm值、谷氨酸產量和糖酸轉化率為考察指標，選用L9（34）正交試驗表對谷氨酸清潔培養基的關鍵影響因素進行研究。正交試驗因素與水平見表1。

表1 谷氨酸清潔發酵培養基組分優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium composition optimization of glutamic acid clean fermentation

1.3.3 檢測分析方法

OD600nm值采用發酵液稀釋100倍后測定的數據再乘以100表示。谷氨酸產量及發酵參數的測定參見參考文獻[11-12]；有機酸的測定使用高效液相色譜分析儀進行。取1mL發酵液于1.5mL離心管中，13000r/min離心2min，取上清液稀釋適當倍數，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾，使用液相色譜儀進行檢測，色譜條件：色譜柱為Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm），0.05 mol/L硫酸緩沖液洗脫，柱溫30℃，流速0.5 mL/min，檢測波長210 nm；采用氨基酸分析儀測定發酵液中氨基酸的含量，發酵液的處理與有機酸相同，稀釋適當倍數后，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾，使用氨基酸分析儀進行定量檢測，色譜條件：色譜柱為LCAK06/Na色譜柱（4.6 mm×150 mm），緩沖液A（乙腈∶水=1∶1）和緩沖液B（4.1 g/L乙酸鈉）洗脫，柱溫57℃，流速0.45 mL/min，檢測波長570 nm和440 nm。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 生物氮素對谷氨酸清潔發酵的影響

在VH（生物素）為5 μg/L，VB1為6 mg/L，甲硫氨酸為1.0 g/L的條件下，不同生物氮素添加量對谷氨酸發酵的影響見圖1。由圖1可以看出，隨著生物氮素的添加量在0.5～1.5 g/L范圍內不斷增加，OD600nm值、谷氨酸產量和糖酸轉化率都呈上升趨勢；當生物氮素添加量為1.5 g/L時，OD600nm值為82、谷氨酸產量為165 g/L、糖酸轉化率為68%；但當生物氮素添加量＞1.5g/L之后，三者的值都呈現波動趨勢，而不是繼續增加。分析可知，在現有的發酵條件下，生物氮素的添加量為1.5 g/L時能夠提供足夠的發酵氮源，不再是發酵的限制性底物，同時，生物量、谷氨酸產量和糖酸轉化率也達到了較高的值。過多的氮源不但造成浪費，而且會改變谷氨酸的代謝途徑[13]，引起異常發酵。因此，選取1.5 g/L作為生物氮素的最佳添加量。

圖1 生物氮素添加量對谷氨酸清潔發酵的影響Fig.1 Effect of biological nitrogen addition on clean fermentation of glutamic acid

2.1.2 生物素對谷氨酸清潔發酵的影響

在生物氮素最佳添加量為1.5 g/L，VB1為6 mg/L，甲硫氨酸為1.0g/L的條件下，不同添加量生物素對谷氨酸發酵的影響見圖2。由圖2可以看出，隨著生物素添加量在3～7μg/L范圍內的增加，OD600nm值不斷增加，谷氨酸產量和糖酸轉化率增加的更快；當生物素添加量為7 μg/L時，OD600nm值為82、谷氨酸產量為166 g/L、糖酸轉化率為67.8%；當生物素量＞7 μg/L之后，OD600nm值增長緩慢，而谷氨酸產量和糖酸轉化率則快速下降。分析可知，由于生物素作為多種尤其是催化脂肪酸合成的乙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸羧化酶等的輔酶，能夠參與細胞膜的合成、CO2的固定和羧化過程[14]。當其添加量增加時，CO2固定反應加強，進一步促進三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA），能夠加快菌體的生長，同時增加谷氨酸產量和糖酸轉化率。但是當生物素的添加量超過“亞適量”范圍后，細胞膜的合成量將大大增加，大量的菌體不能或不完全能實現從非谷氨酸積累型向谷氨酸積累型細胞的轉變[15]。因此，谷氨酸的分泌量和糖酸轉化率開始下降，綜合衡量，選取7 μg/L作為最佳生物素的添加量。

圖2 生物素添加量對谷氨酸清潔發酵的影響Fig.2 Effect of biotin addition on clean fermentation of glutamic acid

2.1.3 VB1對谷氨酸清潔發酵的影響

在生物氮素最佳添加量為1.5 g/L，生物素最佳添加量為7 μg/L，甲硫氨酸為1.0 g/L的條件下，添加不同量VB1對谷氨酸發酵的影響見圖3。由圖3可以看出，隨著VB1添加量在2～8 mg/L的范圍內增加，OD600nm值、谷氨酸產量和糖酸轉化率呈上升趨勢，尤其是后兩者快速增加；當VB1添加量為8 mg/L時，OD600nm值為81、谷氨酸162 g/L和糖酸轉化率為67.5%；而VB1的添加量＞8 mg/L后，OD600nm值不再繼續增加，而谷氨酸產量和糖酸轉化率持續上升，但增加速度變慢。VB1作為谷氨酸生產菌的多種生長因子，它是多種關鍵酶的輔酶和輔基，添加大量的VB1能夠極大提高多種酶的酶活力，加快菌體生長，提高菌活力，進而促進了谷氨酸的分泌和糖酸轉化率的提高[16]。因此，選取8 mg/L作為VB1的最佳添加量。

圖3 VB1添加量對谷氨酸清潔發酵的影響Fig.3 Effect of VB1 addition on clean fermentation of glutamic acid

2.1.4 甲硫氨酸對谷氨酸清潔發酵的影響

在生物氮素最佳添加量為1.5g/L，生物素最佳添加量為7μg/L，VB1最佳添加量為8mg/L的條件下，添加不同量甲硫氨酸對谷氨酸發酵的影響見圖4。由圖4可以看出，OD600nm值和谷氨酸產量隨著甲硫氨酸在0.4～1.2 g/L范圍的增加而不斷增加；而糖酸轉化率在甲硫氨酸添加量在0.4～0.8 g/L范圍呈上升趨勢，當甲硫氨酸的添加量分別為0.8g/L、1.0g/L和1.2 g/L時，其所對應的糖酸轉化率分別為67.6%、67.5%和67.6%，此時糖酸轉化率出現波動，甲硫氨酸已不是影響轉化率的主要因素。甲基化在菌體的生物合成與代謝中發揮著重要的作用，尤其對蛋白質和核酸的修飾加工也極為重要。而甲硫氨酸作為體內最重要的甲基供體，經三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的進一步活化生成S-腺苷甲硫氨酸（最直接有效的甲基供體），能夠提供活化的甲基。四氫乙酸雖然能夠攜帶甲基，但由于轉運勢能低、不能直接將甲基轉移至甲基受體，而是轉移至同型半胱氨酸生成甲硫氨酸[17]。因此，在培養基中添加一定量的甲硫氨酸能夠促進了菌體的快速生長，進而提高谷氨酸產量和糖酸轉化率。因此，選擇0.8 g/L作為甲硫氨酸的最佳添加量。

圖4 甲硫氨酸添加量對谷氨酸清潔發酵的影響Fig.4 Effect of methionine addition on clean fermentation of glutamic acid

2.2 培養基優化正交試驗

以菌體OD600nm值、谷氨酸產量和糖酸轉化率作為考察指標，根據表1所設計的正交試驗進行正交優化，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

由正交試驗結果及極差（R）分析可知，影響OD600nm值的4個因素次序為A＞D＞C＞B，即生物氮素＞甲硫氨酸＞VB1＞生物素，最佳添加量組合為A3B1C3D1，即生物氮素2.0 g/L、生物素5 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6 g/L；影響谷氨酸產量的4個因素次序為B＞A＞C＞D，即生物素＞生物氮素＞VB1＞甲硫氨酸，最佳添加量組合為A3B2C2D2，即生物氮素2.0 g/L、生物素7 μg/L、VB18 mg/L、甲硫氨酸0.8 g/L；影響糖酸轉化率的4個因素次序為B＞C＞A＞D，即生物素＞VB1＞生物氮素＞甲硫氨酸，最佳添加量組合為A2B1C3D1，即生物氮素1.5 g/L、生物素5 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6g/L。

表2 谷氨酸清潔發酵培養基組分優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for clean fermentation medium composition optimization of glutamic acid

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，生物氮素對OD600nm值影響顯著（P＜0.05），生物素對谷氨酸影響顯著（P＜0.05），生物氮素、生物素和VB1對糖酸轉化率影響顯著（P＜0.05）。

綜合考慮以上試驗結果，在滿足一定量OD600nm值的情況下，又同時有較高的谷氨酸產量和糖酸轉化率，因此，最佳添加量組合選取A3B2C3D1，即生物氮素2.0 g/L、生物素7 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6 g/L。

2.3 清潔發酵培養基驗證試驗

2.3.1 清潔發酵培養基對OD600nm值、谷氨酸產量和糖酸轉化率的影響

對照發酵與清潔發酵的考察指標對比情況結果見圖5。由圖5可知，相對于對照發酵，清潔發酵的OD600nm值和谷氨酸產量都有較大的提高，糖酸轉化率雖然不明顯，但是也有一定程度的提升。總的來說，OD600nm值由對照發酵的72.5提升至84.2，提高16.14%；谷氨酸由152 g/L提高至171 g/L，提高12.50%；糖酸轉化率由65.4%提升至68.5%，提高4.74%。

圖5 清潔發酵與對照發酵對考察指標的影響Fig.5 Effects of clean and control fermentation on evaluation indicators

2.3.2 清潔發酵培養基對發酵參數的影響

對照發酵培養基和清潔發酵培養基所獲得的發酵上清液的透光率結果見圖6。

圖6 清潔發酵對發酵液透光率的影響Fig.6 Effect of clean fermentation on the light transmittance of fermentation liquor

由圖6可知，對照發酵的發酵液透光率非常低，因為其含有大量的色素及不可被菌體分解利用的雜質，菌體所產生的影響透光性的物質相對培養基自身的雜質可以忽略不計，因而其透光率呈現穩定的趨勢。而雖然清潔發酵的發酵液透光率隨著菌體產生雜質的增多而不斷下降，但是其總體透光率遠遠高于對照發酵，尤其對后續的谷氨酸分離提取而言，可以大幅度降低生產成本[18]。發酵結束時的對照發酵上清液透光率為0.9%，清潔發酵的上清液透光率為31%。

進一步分析可知，玉米漿、豆粕水解液和糖蜜的替代，大大減少了發酵液中的不可被菌體分解利用的雜蛋白以及有毒害作用的物質，降低了發酵液的黏度、減少了泡沫的生成量、提高了氧的溶解效率[19]。清潔發酵對消泡劑用量及副產物影響的結果見圖7。由圖7可以看出，消泡劑的用量也由對照發酵的1.0 g/L降低至0.7 g/L。由于溶氧效率的提高，對于TCA循環而言，其產生的還原力煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）+H+和黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，FADH2）很大程度上可以使用O2作為氫受體，進而減少丙酮酸作為氫受體，因此副產物乳酸的生成量減少[20]。TCA循環的加強，減少了丙酮酸的積累，進而使得副產物丙氨酸的生成量降低[21]。從圖7可以看出，乳酸的生成量由對照發酵的3.7g/L降低至2.4g/L，丙氨酸的生成量由對照發酵的2.60g/L降低至1.86 g/L。

圖7 清潔發酵對消泡劑用量及副產物的影響Fig.7 Effects of clean fermentation on defoamer dosage and by-products

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗對谷氨酸對照發酵培養基中的關鍵因素進行優化，得到最佳添加量，即生物氮素2.0 g/L、生物素7 μg/L、VB110 mg/L、甲硫氨酸0.6 g/L，獲取谷氨酸清潔發酵培養基。應用生物氮素作為發酵氮源的清潔發酵培養基進行谷氨酸發酵，其獲得的菌體OD600nm值為84.2，谷氨酸產量為171 g/L，糖酸轉化率為68.5%，發酵上清液透光值高達31%。對比可知，本研究所獲得的谷氨酸清潔發酵培養基取得了比對照發酵培養基和復合氨基酸粉或棉籽餅粉作為發酵氮源更好的發酵結果，并解決了谷氨酸生產中色素、雜質多的問題，實現了谷氨酸高效清潔生產。另外，該清潔發酵培養基中是否可以通過添加其他種類的維生素、氨基酸等提高菌體活力的物質，進一步提高谷氨酸發酵效益，有待于更多的研究探索。