EMS誘變高異丁醇耐受性釀酒酵母的篩選

溫智慧，李敬知，馮瑞琪，蘇意德，張愛利*

（河北工業大學 化工學院，天津 300130）

隨著能源不斷短缺和環境不斷惡化，新型能源的開發和利用備受矚目。短鏈醇類作為清潔可再生生物能源，是重要的化工原料，也是化石燃料的理想替代者[1]。其中異丁醇吸濕性低，辛烷值高，其能量密度（27 MJ/L）與汽油（32 MJ/L）相近，燃燒產物對環境無污染[2]，具有良好的應用和發展前景。微生物發酵法生產短鏈醇憑借綠色、低能耗和生產周期短等優勢迅速成為生物能源研究的熱點。然而隨著發酵的進行，代謝產物不斷積累，高濃度的醇類會破壞細胞膜的活性，導致細胞內蛋白質變性[3]，影響線粒體的功能[4]，嚴重抑制發酵過程，如延長發酵時間[5]、降低原料轉化率和下游產品回收率[6]等，因此，篩選一株異丁醇耐受性高的菌株是提高微生物發酵產醇的關鍵。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與其他微生物相比，具有合成異丁醇的天然優勢：DICKINSON J R等[7]在2000年就確定了釀酒酵母細胞可通過L-纈氨酸代謝途徑合成異丁醇，如今其代謝網絡已被研究的相對透徹，易于基因操作[8]。在2011年，CHEN X等[9]在釀酒酵母中過量表達編碼乙酰乳酸合酶基因ILV2，厭氧條件下，異丁醇產率達到了0.97mg/g葡萄糖。在2012年，BRATD等[10]將線粒體中的ILV2、ILV5和ILV3基因定位到細胞質中，同時過量表達編碼苯丙酮酸脫羧酶的基因ARO10，異丁醇產率達到15mg/g葡萄糖。此外，釀酒酵母細胞細胞壁堅韌，抗逆性強[11]，發酵底物來源廣泛，可利用自然界中廣泛存在的木質纖維素[12]，是實現生物發酵產醇的首選微生物。

誘變技術可以彌補一般的基因修飾難以形成生物新性狀的不足，對產生優質基因資源有重要意義。甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）是一類主要作用于細胞內核酸的烷化劑[13]，具有點突變頻率高、突變專一、染色體畸變相對較少等諸多優點[14]。目前，利用EMS誘變技術已成功構建了多種植物的突變體庫，并且成功篩選出了具有優良性狀的植物，如玉米、番茄和擬南芥等[15]，而將其應用于微生物的研究相對較少。

為了得到異丁醇耐受性良好的菌株，進一步提高異丁醇的發酵產量，本實驗利用EMS誘變釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A，篩選出數株突變菌株，通過對比細胞生長及耗糖情況，得到了一株遺傳穩定、異丁醇耐受性良好且發酵能力相對較強的突變菌株。在上述篩選得到的突變菌株中過量表達L-纈氨酸代謝途徑中的節點基因ILV2、ILV5、ILV3和ARO10并對其發酵性能進行檢測，得到一株異丁醇耐受性良好且發酵產物產量較高的工程菌株，為進一步提高釀酒酵母細胞生產異丁醇的能力提供了新思路，為實現新型能源異丁醇投入發酵工業生產奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A：河北工業大學菌種保藏室保藏。

1.1.2 化學試劑

甲基磺酸乙酯（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；限制性內切酶（10 U/mL）、T4 DNA連接酶（10 U/mL）：美國Thermo Scientific公司；Taq DNA聚合酶（500 U/mL）：北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母抽提物，20 g/L葡萄糖，固體培養基添加2%瓊脂粉，pH自然，121℃滅菌20min；

含異丁醇的YPD培養基：在YPD培養基中加入體積分數0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的異丁醇；

完全選擇培養基：6.7g/L無氨基酸酵母氮源（yeastnitrogenbase without amino acids，YNB），20 g/L葡萄糖，2 g/L除去標記氨基酸的氨基酸混合物，pH值為5.6，固體培養基添加2%瓊脂，pH值為6.5，121℃滅菌20 min。

1.1.4 引物及質粒

實驗中所用的質粒和引物分別如表1和表2所示。

表1 本研究中所用質粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究中所用引物序列Table 2 Sequences of primers used in this study

1.2 儀器與設備

SHK-99-Ⅱ臺式空氣恒溫搖床：北方同正生物技術發展有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；Hema3200聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：珠海黑馬醫學儀器有限公司；721G紫外可見光分光光度計：上海儀電（集團）有限公司；Centrifuge5424高速離心機：上海艾本德生物技術國際貿易有限公司；1260型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC）：美國Agilent公司；SCION 456-GC氣相色譜儀（gas chromatograph，GC）：布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母細胞活化

將釀酒酵母細胞接種于5 mL YPD液體培養基中，于30℃空氣浴搖床中200 r/min振蕩培養16 h。

1.3.2 平板稀釋法稀釋細胞

將釀酒酵母W303-1A活化后，取適量菌液于紫外分光光度計下測定其在波長600nm處的OD600nm值。將菌液OD600nm值調節為1，依次10倍稀釋菌液稀釋度至101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別取10 μL上述不同稀釋度的菌懸液，滴于YPD固體培養基上，于30℃恒溫培養箱中培養2～3 d，觀察菌落數。

1.3.3 W303-1A的異丁醇耐受性

將活化后的細胞懸液稀釋至合適倍數，取100 μL分別涂于含異丁醇體積分數為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的YPD固體培養基上，于30℃恒溫培養箱中培養2～3 d，觀察細胞生長情況。

1.3.4 EMS含量的確定

將菌株W303-1A活化后，于13000r/min離心收集細胞，用磷酸緩沖液洗滌兩次，離心去上清。用1 mL磷酸緩沖液重懸細胞后，加入EMS原液，使EMS終質量濃度分別為0、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL，70 μg/mL，置于30℃、200 r/min搖床中培養30 min。向上述離心管中加入1 mL 5 mg/100 mL的硫代硫酸鈉溶液，繼續搖床培養10min以解除EMS的毒性。從搖床中取出菌懸液，13 000 r/min離心5 min收集細胞，按稀釋平板法稀釋至10-3，然后分別取40 μL涂布于含有不同含量異丁醇的YPD固體培養基上，于30℃培養箱培養2～3 d。觀察菌株生長情況，并計算致死率，其計算公式如下：

1.3.5 突變菌株的篩選

釀酒酵母菌W303-1A經EMS誘變后按稀釋平板法稀釋至合適的OD600nm值，涂于含2%異丁醇的YPD固體培養基上，同時涂在不含異丁醇的YPD固體培養基上作對照。觀察細胞生長情況并計數，篩選出生長旺盛的菌株重新培養于含3%異丁醇的YPD培養基上再次進行耐受性篩選，連續培養至第8代，驗證遺傳穩定性。

1.3.6 重組質粒與工程菌的構建

以釀酒酵母W303-1A染色體為模板，利用PCR擴增出所需目的基因ILV2、ILV5、ARO10、ILV3，純化后用對應的限制性核酸內切酶進行切割。限制性內切酶失活后用T4 DNA連接酶將目的基因ILV2、ILV5與強啟動子PGK1p相連后分別插入帶有標記基因的高拷貝質粒YEplac195和YEplac112中，構建重組質粒YEplac195-PGK1p-ILV2（Y2）和YEplac112-PGK1p-ILV5-GFP-CYC1（Y5），將目的基因ARO10與強啟動子TDH3p相連后插入帶有標記基因的高拷貝質粒YEplac181中，構建重組質粒YEplac181-TDH3p-Cox4-ARO10-GFP-CYC1（Y10），以上3種質粒轉入釀酒酵母中，通過質粒高拷貝數和強啟動子實現ILV2、ILV5、ARO10基因的過量表達。以相同的方法將ILV3基因兩端插入帶有δ5'及δ3'基因片段的質粒pUC18中，構建重組質粒pUC18-δ5'-His-PGK1p-ILV3-δ3'（P3），轉入釀酒酵母后，該質粒以δ整合的方式過量表達基因ILV3。擴增基因所用引物序列及其酶切位點如表2所示。利用醋酸鋰轉化法將質粒轉化到釀酒酵母細胞中，涂于完全選擇培養基上，通過質粒上的標記基因篩選轉化子。

1.3.7 微厭氧發酵

菌株過夜活化后，以初始OD600nm值=0.2接入20 mL完全選擇培養基中，30℃、200 r/min搖床培養16 h。取適量菌液以初始OD600nm值=0.2接入100mL發酵培養基（含40g/L葡萄糖的完全選擇培養基）中，30℃、100 r/min微厭氧發酵36 h。

1.3.8 菌株生長及發酵性能的檢測

在發酵過程的各個時間節點取樣，利用紫外可見分光光度計和3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法分別測定發酵液細胞濃度及殘糖量，繪制生長曲線和耗糖曲線。利用高效液相色譜與氣相色譜分別測定發酵液中乙醇及乙酸的產量，其色譜條件為Carbomix H-NP色譜柱（7.8mm×300mm×10μm）及示差折光檢測器，2.5mmol/L H2SO4作為流動相，流速0.6 mL/min，柱溫55℃，檢測器溫度35℃。采用氣相色譜儀測定異丁醇的產量，其色譜條件為HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.32 mm），柱溫為80℃，維持10 min，進樣口溫度穩定在200℃，檢測器的溫度穩定在300℃。異丁醇產率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 對照型釀酒酵母異丁醇耐受性的測定

由圖1A可知，通過平板稀釋法將培養液的OD600nm值稀釋至10-4時可看到清晰的單菌落，稀釋至10-5未長出單菌落，因此確定將菌液稀釋至10-4后點樣；由圖1B可知，出發菌株W303-1A在含異丁醇體積分數為2.0%和3.0%的培養基上不能生長。因此，篩選出能對2.0%及更高含量的異丁醇耐受性的菌株具有較高研究意義。

圖1 不同稀釋度培養液（A）和不同含量異丁醇（B）對菌株W303-1A的影響Fig.1 Effect of fermentation broth with different dilutions(A)and different isobutanol contents(B)on the growth of strainW303-1A

2.2 EMS誘變條件的確定

利用EMS可使釀酒酵母細胞產生突變，但過高濃度的EMS會導致細胞死亡，因此，為了得到最佳的突變效果，需要測定相對適宜的EMS誘變濃度。分別用不同濃度的EMS誘變等量活化過的釀酒酵母細胞W303-1A，誘變完成后分別取適量上述菌液稀釋至10-3涂布于YPD固體培養基上培養，并計算致死率，結果見圖2。

由圖2可知，當EMS質量濃度為40 μg/mL時，釀酒酵母細胞致死率為78%，根據之前的實驗研究，致死率為70%～90%時，EMS的誘變效果最佳[18]。因此，選擇處于最適EMS質量濃度即40 μg/mL對菌株W303-1A誘變。

圖2 EMS質量濃度與致死率關系Fig.2 Relationship between EMS concentration and fatality rate

2.3 高異丁醇耐受性菌株的篩選

釀酒酵母菌W303-1A經數次EMS誘變及篩選后，共得到60株突變菌株。結果見圖3。

圖3 突變菌株在YPD培養基與含2%異丁醇YPD培養基上的篩選結果Fig.3 Screening results of mutant strains on YPD medium and YPD medium with isobutanol 2%

由圖3可知，通過對比含在有2%（V/V）異丁醇的YPD培養基上稀釋度為10-3和10-4時的單菌落的個數及大小可以發現，1#、10#、18#、20#～22#、24#、26#、28#、30#～32#、37#～40#、42#、44#、47#、49#、50#和57#～60#突變菌株生長相對良好，其中7株可在含3%（V/V）異丁醇的YPD培養基上生長，結果如圖4所示。

圖4 突變菌株在YPD培養基與含3%異丁醇YPD上的篩選結果Fig.4 Screening results of mutant strains on YPD medium and YPD medium with isobutanol 3%

由圖4可知，通過對比在含有3%異丁醇的YPD培養基上稀釋度為10-3和10-4時的單菌落個數及大小可以發現，18#、38#、39#和40#菌株生長能力較強。因此，選擇18#、38#、39#和40#菌株驗證遺傳穩定性后進行發酵性能的檢測。

2.4 突變菌株的發酵性能檢測

將18#、38#、39#和40#突變菌株及對照菌株W303-1A進行微厭氧發酵，測定其生長曲線和葡萄糖消耗曲線，結果見圖5。

圖5 突變菌株與對照菌株的生長（a）及耗糖（b）情況Fig.5 The cell growth(a)and glucose consumption(b)of mutant strains and the control strain

如圖5a所示，39#突變菌株生長速率明顯高于18#、38#、40#突變菌株和對照菌株W303-1A，細胞濃度最大，OD600nm值達到16。18#、38#、40#株突變菌株與303-1A的相比，生長速率和細胞濃度差異不大。

如圖5b所示，39#突變菌株耗糖能力明顯強于18#、38#、40#突變菌株和對照菌株W303-1A，在10 h時葡萄糖基本消耗完。而對照菌株W303-1A在發酵12 h時將培養基中的葡萄糖耗盡，18#、38#和40#突變菌株在發酵14 h后逐漸將葡萄糖耗盡。因此，選定異丁醇耐受性最佳、生長能力最強的39#突變株（EMS39）作為宿主菌，進一步優化其合成異丁醇的能力。

2.5 工程菌株的構建及微厭氧發酵能力檢測

將重組質粒Y2、Y5、Y10和P3共轉化突變株EMS39和對照菌W303-1A中，得到工程菌株EMS39 23510和W303-1A 23510。將對應的4個空載體轉化入對照菌W303-1A中得到菌株W303-1A-EP（對照菌）。然后將上述3株菌同時進行微厭氧發酵實驗，在發酵的各個時間節點取樣測定菌體生長能力及葡萄糖消耗能力，結果見圖6。在發酵的各個時間節點取樣測定菌株產異丁醇、乙醇和乙酸的能力，各時間節點發酵液中異丁醇、乙醇和乙酸的濃度結果見圖7。

圖6 工程菌和對照菌的生長（a）和耗糖情況（b）Fig.6 The cell growth(a)and glucose consumption(b)of engineering strains and the control strain

如圖6a所示，在發酵前8h內菌株EMS3923510、W303-1A 23510和對照菌W303-1A-EP生長速率基本相同，8 h后菌株EMS39 23510、W303-1A 23510的生長速率高于對照菌，在24 h后3株菌生長濃度達到最大值。其中菌株W303-1A 23510細胞濃度最大，生長能力最強，出發菌株W303-1A細胞濃度最小，生長能力最弱。

如圖6b所示，菌株EMS39 23510和W303-1A 23510耗糖速度較快，32 h后兩株工程菌的葡萄糖基本耗盡，而菌株W303-1A-EP耗糖速度相對較慢，于48 h后葡萄糖耗盡。由此看出，突變菌株EMS39與出發菌株W303-1A相比，生長及耗糖能力明顯提高。

圖7 工程菌和對照菌發酵產異丁醇（a）、乙醇（b）及乙酸（c）結果Fig.7 Results of isobutanol(a),alcohol(b)and ethanoic acid(c)productions by the fermentation of engineering strains and the control strain

如圖7a所示，菌株EMS39 23510和W303-1A 23510的異丁醇產量在發酵24h之后逐漸提高。菌株EMS3923510在32 h時異丁醇產量達到404.2 mg/L，菌株W303-1A 23510在60 h異丁醇產量達到389.1 mg/L。在整個發酵期間，對照菌W303-1A-EP的異丁醇質量濃度提高并不明顯，在48 h產量最高，為64.2 mg/L。對比3株菌的異丁醇產量可知，菌株EMS39 23510比菌株W303-1A-EP提高了529.6%，比菌株W303-1A 23510提高了3.9%，異丁醇產率達到10.11 mg/g葡萄糖，與菌株W303-1A-EP相比提高了530.0%。

如圖7b所示，菌株EMS39 23510的乙醇產量依然高于菌株W303-1A 23510和對照菌W303-1A-EP。菌株EMS39 23510乙醇產量于32 h達到最高，為4 342.9 mg/L，菌株W303-1A 23510和W303-1A-EP和分別于60 h和48 h產量達到最高，分別為4 157.6 mg/L和3 449.3 mg/L。

如圖7c所示，菌株EMS39 23510乙酸產量明顯高于菌株W303-1A 23510和W303-1A-EP。菌株EMS39 23510的乙酸產量在32 h之后達到最大值，為1 196.4 mg/L，并基本維持在1165.1mg/L。而菌株W303-1A 23510和菌株W303-1A-EP的最高乙酸產量分別為454.6 mg/L和434.1 mg/L，發酵48 h之后產量最低，均為22.4 mg/L。

3 結論

本實驗利用化學試劑EMS對釀酒酵母菌株W303-1A進行誘變，確定了突變劑EMS作用的最適的質量濃度為40 μg/mL。篩選得到60株可在含2%異丁醇的YPD培養基上生長的突變菌株，其中7株可在含3%異丁醇的YPD培養基上生長。通過測定生長和耗糖情況，篩選得到1株遺傳穩定、耐受異丁醇良好發酵優勢菌株EMS39。

在EMS39中過量表達ILV2、ILV5、ILV3和ARO10基因，得到EMS39 23510。發酵數據顯示，菌株EMS39 23510發酵產物與W303-1A 23510和對照菌W303-1A-EP相比，產量明顯提高，其中異丁醇產量提高尤為明顯，在32 h時達到404.2 mg/L，比菌株W303-1A-EP提高了529.6%，比菌株W303-1A 23510提高了3.9%；異丁醇產率達到10.11 mg/g葡萄糖，比菌株W303-1A-EP提高了530.0%；乙醇和乙酸產量較對照菌W303-1A-EP相比分別提高了25.9%和175.6%，與菌株W303-1A 23510相比分別提高了4.5%和163.2%。

菌株EMS39 23510生長和發酵能力較強，也是基因工程操作的優質宿主菌。本工作構建的突變體庫在釀酒酵母發酵產異丁醇研究方面具有重要意義，同時，為進一步提高微生物發酵能力提供了新思路，在一定程度上為實現新型能源的開發和利用奠定了基礎。