基于氣質聯用法的兩種香型白酒揮發性成分差異分析

楊 亮，占楊楊，魏 剛，陳守文，馬 昕*

（1.茅臺學院釀酒工程系，貴州 仁懷 564501；2.湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢 430062；3.茅臺學院 食品工程系，貴州 仁懷 564501）

中國白酒歷史悠久，釀造工藝精湛。作為世界蒸餾酒產量及消費量最大的國家[1]，我國2016年白酒（折65%vol）總產量及消費量分別為135.84億L及135.70億L[2]。我國現已認證的白酒香型有13種，其中醬、濃、清、米為四大基本香型，其余香型為在此基礎上衍生出來的新香型[3-4]。醬、濃香型白酒分別占據白酒行業利潤第一及市場占有第一。

白酒中水和乙醇約占98%，香味物質只占2%左右，而白酒的香型、風格和品質卻取決于這僅占2%的香味物質的成分、含量及其量比關系[5]。隨著人們對白酒健康、品質等方面要求的提高，酒類相關研究也逐步拓展，現主要集中在白酒保健、白酒風味組學、白酒安全等領域[6-8]。白酒相關領域研究多以醬香和濃香中的一種作為研究對象[9-11]，極少關于對這兩種香型進行比較分析的報道，也僅檢測了單一品牌不同香型白酒組分差異或對不同香型進行了初步的成分聚類[12-13]。將不同流派、風格的兩種香型白酒進行主成分分析后，再進行揮發性物質差異分析的研究少見報道，醬、濃香型白酒揮發性物質的區別，至今沒有準確、全面的表述。

本研究旨在用氣相色譜質譜聯用（gaschromatographymass spectrometry，GC-MS）技術通過直接進樣分析不同風格和流派的醬、濃香型白酒的揮發性物質。在主成分分析（principal component analysis，PCA）的基礎上，進一步研究不同香型白酒間揮發性物質差異，討論釀造工藝與組分間的關系，從而深入了解白酒香型、流派、揮發性物質及釀造工藝間的聯系。本研究的開展對充分認識白酒風格的實質具有積極意義，同時對開發新型風味白酒具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水硫酸鈉、丙酮（均為分析純）：國藥集團上海化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）：美國Thermo Fisher Scientific公司。

酒樣：分別來自貴州、四川和江蘇，相關信息見表1。

表1 實驗白酒酒樣信息Table 1 Information of the Baijiu samples used in the experiment

1.2 儀器與設備

Trace 1300型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、TSQ8000 Evo質譜（mass spectrometry，MS）儀：美國賽默飛世爾科技公司；ME204E型萬分之一天平：瑞士梅特勒-托利多國際有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣前處理

為了最大程度地保留樣本內的化學成分，本方法采用直接進樣分析。將選取的實驗酒樣樣本各取1 mL，加入3 g無水硫酸鈉，混勻，過夜，12 000 r/min離心3 min，取上清液使用0.22 μm有機濾膜過濾后，即上機測試。

1.3.2 色譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為TG-WAX毛細管柱（30 m×0.25mm，0.25μm）；進樣方式為不分流進樣；載氣（He）流速1.2 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1 μL，進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持1 min；以6℃/min升溫至230℃，保持15 min；總分析時間為45 min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源：電子能量70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；傳輸線溫度：230℃。定性采用全掃描模式；質量掃描范圍35～600 m/z。

1.3.3 定性和定量分析

定性分析方法：經過分析得到的圖譜和美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫中的標準圖譜進行比對，保留匹配度＞80%的組分。

定量分析方法：采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.3.4 數據處理

實驗數據采用Trace Finder 4.1、SIMCA 14、Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 揮發性物質及主成分聚類分析

不同香型白酒中揮發性物質的GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1。由圖1可知，醬香型酒樣揮發性物質種類多于濃香型酒樣。經過GC-MS數據庫比對分析，檢測出醬香型酒樣揮發性物質62種，定性60種；濃香型酒樣檢測出揮發性物質36種，定性35種。將兩種香型白酒定性出的揮發性物質進行組成種類分析，結果見圖2。由圖2可知，醬香型酒樣揮發性物質中的各類化合物種類均居濃香型酒樣之上，這與醬香型白酒獨特的“四高”釀造工藝是分不開的。發酵期的高溫可以促進多種物質的生成，而高溫蒸餾則使揮發性物質最大限度的收集到酒中，從而使醬香型白酒揮發性物質種類較多。因此，推測揮發性物質種類的差異是導致醬、濃香型白酒酒體具有不同風格特征的原因之一[14]。

圖2 醬、濃香型酒樣不同類型揮發性物質組成差異Fig.2 Composition differences of volatile compounds between sauce-flavor Baijiu and strong-flavor Baijiu

主成分分析（PCA）是一種基于最大統計學距離投影的降維方法，可以較好地應用于不同白酒的分析。采用SCIMA 14對酒樣進行主成分分析，結果見圖3。由圖3可知，醬、濃香型白酒主成分累計貢獻率為73.50%，能有效描述揮發性物質和酒樣之間的復雜關系，PCA可用于區分這兩種香型白酒。在同一95%置信區域（Hotelling T2 test）的兩種香型白酒，能各自較好的分開，聚類趨勢明顯，并具有直觀的可視化區分效果，可推測出兩種不同香型白酒香型與其揮發性物質有直接聯系。

圖3 酒樣中揮發性物質主成分分析Fig.3 Principal components analysis of volatile compounds in Baijiu samples

4種醬香型酒樣中，M1～M3酒樣取自同一酒廠，3者PCA分布非常集中，這說明本檢測方法穩定性較好；M4與M1～M3取自不同地區，但釀造工藝相似[15]，均為大曲醬香，而且M4與M1～M3的PCA分布接近，說明組分構成非常相似。

由圖3可知，濃香型酒樣PCA分布較醬香型酒樣相對離散，揮發性物質分別集中在第一和第四象限。濃香型4種酒樣分屬兩大濃香型白酒流派，S1和S2為川派代表，S3和S4為江淮派代表。除釀酒原料有所區別外，兩種流派濃香酒樣的發酵工藝各有的特點，S1和S2為跑窖法工藝，S3和S4為老五甑法工藝[16]。這說明，即使是同種香型的白酒，不同的釀造工藝會對揮發性物質的形成造成一定影響。結果表明，酒樣揮發性物質成分越接近，PCA分布越集中，基于主成分分析的方法能有效展現白酒不同香型、不同流派的揮發性物質的個性與共性，能反應白酒的實質，白酒的風格由它含有的揮發性物質決定。

2.2 不同香型白酒揮發性物質差異分析

醬、濃香型酒樣揮發性物質的GC-MS檢測數據，根據二位矩陣數據信息分析得到的Heatmap圖及揮發性物質相對含量差異分別見圖4和表2。

圖4 醬、濃香型白酒揮發性物質差異分析熱圖Fig.4 Heatmap of differences analysis of volatile compounds in sauce-flavor Baijiu and strong-flavor Baijiu

由圖4可知，醬、濃香型酒樣在48種揮發性物質含量上有所差異，其中39種存在顯著差異（P＜0.05），且醬香型酒樣有33種物質相對含量高于濃香型酒樣。48種揮發性物質中醇類物質9種，醛類物質2種，酸類物質10種，酯類物質15種，酮類物質2種，呋喃類物質4種，吡嗪類物質3種，以及8種其他類物質。

5-甲基糠醛、苯乙酸乙酯和琥珀酸乙酯是醬、濃香型酒樣中揮發性成分具有顯著差異的前三種物質，這三種物質也是醬、濃香型白酒重要的呈香物質[17-19]，且在醬香型酒樣中的含量均高于濃香型酒樣。不僅如此，醬香型白酒獨特的“四高”工藝，促進了呋喃類及吡嗪類化合物的生成，這兩類物質在醬香型酒樣中的含量分別是濃香型酒樣的7.54倍和46.95倍，這與傳統的醬香型白酒酒體中糠醛及含氮化合物的含量居各香型之首的認知相符[20-21]。另外，醬香型酒樣中醇類物質相對含量是濃香型酒樣的2.53倍，其中以對白酒香氣有顯著貢獻的香味活性物質β-苯乙醇含量差異最大[22]。醇類物質在白酒中有協調香氣和“助香”的作用，有利于白酒呈香，而醇類物質含量的差異或許是影響醬、濃香型白酒放香差異的原因之一。

表2 醬、濃香型白酒揮發性物質差異分析Table 2 Differences analysis of volatile compounds between sauce-flavor Baijiu and strong-flavor Baijiu

續表

雖然醬香型酒樣的酯類物質種類多于濃香型酒樣（見圖2），但酯類物質作為濃香型白酒的主體香[23]，濃香型酒樣中酯類物質的相對含量卻是醬香型酒樣的2.63倍，具有顯著差異（P＜0.05），且在濃香型酒樣中相對含量高于醬香型酒樣的前三種物質均為酯類物質，分別為己酸異戊酯、己酸己酯、己酸乙酯。作為四大酯之一的己酸乙酯，是濃香型白酒的主體香味物質[24]，因己酸乙酯的閾值較低，賦予了濃香型白酒“窖香濃郁”之感[25]。

醬、濃香型白酒發酵工藝不同，泥窖發酵是濃香型白酒最具特色的釀造工藝之一。泥窖中的微生物代謝出多種對酒體有貢獻的揮發性物質，但代謝出的一些異嗅物質也會進入酒體，如產生窖泥臭的主要物質4-甲基苯酚[26]，由表2可知，它在濃香型酒樣中的相對含量是醬香型酒樣的16.67倍，與己酸的相對含量相同。兩種香型酒樣酸類物質含量相當，但有一些因釀造工藝不同而造成相對含量有明顯差異的酸類物質，如濃香型酒樣中的乙酸和己酸相對含量分別是醬香型酒樣的0.22倍和16.67倍。這是由于濃香型白酒釀造所用的窖泥中含有大量的己酸菌，會促使乙酸向己酸轉化，而醬香型白酒釀造的條石窖池中的己酸菌含量非常少。因此醬香型白酒中的乙酸含量高于濃香型白酒，而己酸含量遠低于濃香型白酒。

3 結論

本研究采用氣相色譜-質譜技術（GC-MS）對醬、濃香型酒樣的揮發性成分進行檢測分析。醬香型酒樣中檢測出揮發性物質62種，定性60種。濃香型酒樣檢測出揮發性36種，定性35種。隨后，通過PCA分析發現，兩種香型酒樣聚類趨勢明顯，能根據揮發性物質將兩種香型較好的區分。濃香型酒樣PCA聚類離散成兩大類，PCA能客觀反應出不同流派的濃香型白酒揮發性成分的差異。

醬、濃香型酒樣在48種揮發性物質含量上有差異。醬香型酒樣的呋喃類、吡嗪類及醇類化合物分別是濃香型酒樣的7.54倍、46.95倍和2.53倍。醬香型酒樣中酯類物質的種類多于濃香型，但濃香型酒樣中酯類物質相對含量卻是醬香型酒樣的2.63倍，且酒體中的己酸異戊酯、己酸己酯、己酸乙酯等酯類含量顯著高于醬香型酒樣。不同香型白酒的釀造工藝特點，會相應的造成酒體中的揮發性物質的差異，如濃香型酒樣中的4-甲基苯酚、己酸和乙酸分別是醬香型酒樣的16.67倍、16.67倍和0.22倍。釀造工藝的區別導致了酒體揮發性物質的差異，賦予了醬、濃香型白酒不同的風格特點。