兩個品種桃蒸餾酒中甲醇含量差異性研究

劉 文，孫玉霞，趙新節*

（1.齊魯工業大學 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353；2.山東省農業科學院農產品研究所 山東省農產品精深加工技術重點實驗室，山東 濟南 250100）

桃蒸餾酒是以桃子為原料，發酵釀制后經蒸餾而成，其不僅保留了桃子原來的水果香氣，且經過蒸餾后產生了更豐富的香味物質，口感醇厚，營養豐富[1]。但桃蒸餾酒中的甲醇含量偏高往往是生產的限制因素。甲醇是一種劇毒物質，攝入后被氧化為甲酸，毒害人的中樞神經系統。當酒中的甲醇含量＞340mg/L時，飲用者可發生中毒反應，嚴重者可致失明或死亡[2]。因此，甲醇含量是酒精發酵階段應控制的參數之一，應嚴格制定標準控制以便提供安全的果酒。在歐盟的標準中，以水果為原料的蒸餾酒中甲醇含量限制為＜4 g/L（以酒精度40%vol計算）[3]；美國對于以水果為原料的蒸餾酒的標準是甲醇含量≤2.80g/L（以酒精度40%vol計算）[3]；我國GB 2757—2012《食品安全標準蒸餾酒及其配制酒》中規定了蒸餾酒的甲醇含量標準如下：除以糧谷為原料的蒸餾酒外，其他蒸餾酒中甲醇含量應＜2.00 g/L（以酒精度換算到100%vol計）[3]。

LIANG M H等[4]通過篩選酵母突變體來降低酒中甲醇的含量；遲超逸等[5]研究了紅棗白蘭地中甲醇的形成機理；CABAROGLU T等[6]對100多種葡萄酒樣進行了甲醇含量的分析，試驗證明了甲醇含量與破碎時果膠的進入有直接的關系。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）能催化非甲基果膠或多聚半乳糖醛酸的水解，隨機的從多聚半乳糖醛酸鏈內部打開α-1,4糖苷鍵，從而加快酶的分解產生甲醇[7]。果膠酯酶（pectinesterase，PE）是一種能催化、水解果膠，生成果膠酸和甲醇的酶，與甲醇的產生直接相關[8]。桃子中果膠的含量可占果實質量的0.56%～1.25%。果膠是一種高分子多糖，由不同酯化度的半乳糖醛構成[9]，果膠作為果膠酯酶的作用底物，其含量越高，果膠酶解產生甲醇的幾率越大。

本研究通過探究甲醇含量與PG活性、PE活性及果實中果膠含量的相關性情況，分析兩個品種的桃蒸餾酒中甲醇含量的差異性原因，進而探究桃酒中甲醇生成的原理及甲醇產生量控制的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

倉方早生和中華壽桃：山東省臨沂市；體積分數95%乙醇：天津市廣成化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；甲醇（色譜純）：美國TEDIA公司；果膠酶EX、果膠酶HC：上海康禧食品飲業有限公司；酵母EC1118：上海杰兔工貿有限公司；焦亞硫酸鉀（分析純）：天津市科密化學試劑開發中心；桃子果膠：實驗室制備；低酯果膠（酯化度44%）、多聚半乳糖醛酸（純度≥97%）、柑橘果膠：北京索萊寶科技有限公司。

模擬發酵培養基參考李慧等[10]的方法配制：葡萄糖200 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，酒石酸6 g/L，蘋果酸2 g/L，檸檬酸0.5 g/L，磷酸氫銨1 g/L，硫酸銨1 g/L，去離子水1 000 mL，pH 3.8。120℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

WYT-Ⅲ糖度計：成都豪創光電儀器有限公司；AMR-100全自動酶標分析儀：杭州奧盛儀器有限公司；0-100酒精計：河北衡水武強縣同輝儀表廠；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；Neofuge15R冷凍離心分離機：力新儀器上海有限公司；BS124S電子分析天平、PB-10精密pH計：德國賽多利斯公司；7890B氣相色譜儀（gaschromatograph，GC）（配氫火焰離子化檢測器（flameionizationdetector，FIR））：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣及編號

由于不同時期果實中的果膠酶及果膠含量不同，為了增加試驗的準確性，分別收集3個不同采摘時期的倉方早生和中華壽桃兩個品種作為研究試樣，且每個時期分別做3個平行處理。對不同時期及不同品種采樣的桃子進行編號。其中倉方早生正常成熟期為7月中旬，M1為稍早熟的狀態，果實上色淺；M2為正常熟狀態；M3為過熟狀態，果實明顯軟化嚴重；而中華壽桃的正常成熟期為9月中下旬，Z1為早熟的狀態，果實堅硬且顏色為較深的綠色；Z2為正常熟狀態；Z3果實為稍過熟狀態，果實顏色變淺，出汁率明顯增加，但果實沒有發生明顯的軟化。

1.3.2 桃蒸餾酒加工工藝及操作要點

桃子→去核后打漿入罐→添加焦亞硫酸鉀→添加活化酵母→25℃條件下發酵→皮渣分離→發酵酒→蒸餾→桃蒸餾酒

操作要點：桃子去核后切塊進行打漿，放入20 L的小型發酵罐中，先加入焦亞硫酸鉀，添加量為50 mg/L，再加入酵母EC1118，添加量為0.3 g/L，25℃條件下發酵12 d（酒精度或殘糖含量基本不變時結束發酵），不添加任何果膠酶。發酵結束后的桃酒進行蒸餾，蒸餾后酒精度約為45%vol，再測定其甲醇含量。

1.3.3 模擬發酵試驗設計

采用單因素模擬培養發酵的方法，分別探究果膠酶、果膠含量及果膠酯化度對桃蒸餾酒中甲醇含量的影響，按照表1中進行編號處理，加入酵母EC1118進行發酵試驗，發酵結束后，取酒樣進行甲醇含量的測定，分別做3組平行。

表1 模擬發酵試驗設計及編號Table 1 Design and number of simulated fermentation test

1.3.4 理化指標的測定

總糖含量：采用苯酚-硫酸法[11]測定；還原糖及殘糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[12]測定；總酸含量：采用酸堿滴定法[13]測定；pH：采用pH計法[13]進行測定；可溶性固形物含量：采用手持折光儀測定。

1.3.5 甲醇含量的測定

采用氣相色譜法測定甲醇含量，其色譜條件及定性定量的方法參見文獻[2]。

1.3.6 多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶活性的測定

多聚半乳糖醛酸酶活定義：每小時在40℃催化半乳糖醛酸水解生成1 mg半乳糖醛酸所需的酶量，即mg/（h·g）蛋白質。果膠酯酶活定義：以單位體積酶液1min內消耗1mmol NaOH作為一個活性單位（U/g）。

配制一系列已知濃度的標準葡萄糖溶液，按照3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量方法[14]，用0號管作為參比調零，在波長540 nm處測定吸光度值，以葡萄糖質量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=0.315 9x-0.026 1，相關系數為R2=0.999 5。

多聚半乳糖醛酸酶活性測定：稱10 g新鮮桃組織，加入1mL的0.2mol/L的NaCl溶液，進行冰浴勻漿。16000×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液置于冰上待測。取上清液，加入0.5%的多聚半乳糖醛酸溶液和pH 4.5的醋酸鈉緩沖液，40℃水浴30 min后，加入3,5-二硝基水楊酸，沸水浴5 min后，在波長540 nm條件下測定其吸光度值。多聚半乳糖醛酸酶活計算公式如下：

式中：X多聚半乳糖醛酸酶活，mg/（h·g）；m'為從半乳糖醛酸標準曲線中查得的葡萄糖質量，mg；V為樣品提取總體積，mL；Vs為測定時所取樣品體積，mL；t為酶促反應時間，h；m為樣品質量，g。

果膠酯酶活性測定方法：取1 g新鮮桃組織，加入少量的pH=3.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液進行溶解，研缽預冷，進行研磨提取，8 000×g、4℃條件下離心15 min，取上清液置于冰上待測。取上清液2 mL，37℃預熱3 min，加入酚酞指示劑2滴，加1%柑橘果膠8 mL，用0.01 mol/L NaOH溶液滴定至淡紅色，記錄30min內其保持淡紅色所消耗的NaOH溶液的體積。果膠酯酶活計算公式如下：

式中：Y為果膠酯酶酶活，U/g；VNaOH為消耗NaOH滴定液體積，mL；CNaOH為NaOH滴定液濃度，mol/L；VPME為加入粗酶液體積，mL；tPME為酶促反應時間，min。

1.3.7 果膠含量的測定

果膠是由非水溶性原果膠和可溶性果膠組成，均可采用咔唑比色法測定果膠含量[15]。

1.3.8 數據處理

采用SPSS 20.0和Origin 8.5處理數據，結果以（平均值±標準偏差）表示。

2 結果與分析

2.1 兩個品種桃果實的理化指標

由表2可知，3個不同時期中華壽桃果實的總糖含量、總酸含量普遍高于倉方早生果實，其中總酸含量差別較大（P＜0.05），倉方早生中M3總酸含量最高為（2.35±0.05）g/L，中華壽桃中Z3總酸含量最高為（4.27±0.09）g/L；兩個品種桃子果實的pH無明顯差異（P＞0.05）；中華壽桃的可溶性固形物含量總體顯著高于倉方早生的其含量（P＜0.05）。可以看出，倉方早生隨著采摘日期的延長，總糖含量由最高（98.88±0.41）g/L，逐漸降低最后趨于穩定；中華壽桃隨著采摘日期的延長，總糖含量上升幅度大，其中Z3的總糖含量達到最大，為（129.49±2.18）g/L。總體來看，兩個桃子品種果實理化指標差異較大。

表2 兩個品種桃子果實的理化指標Table 2 Physicochemical indexes of two varieties of peach fruits

2.2 兩個品種桃蒸餾酒的甲醇含量

圖1 不同桃蒸餾酒樣品中甲醇的含量檢測結果Fig.1 Determination results of methanol contents in different peach distilled liquor samples

對不同品種桃蒸餾酒中的甲醇含量進行檢測，結果見圖1。由圖1可知，不同時期倉方早生蒸餾酒中的甲醇含量均大于中華壽桃蒸餾酒中的其含量，其中倉方早生中M1蒸餾酒中甲醇含量最高，為（5.11±0.28）g/L，中華壽桃中Z1蒸餾酒中甲醇含量最高，為（0.61±0.18）g/L，可見兩個品種的桃蒸餾酒中甲醇含量差別很大，在控制發酵條件相同的情況下，進一步推測桃蒸餾酒中甲醇含量差異大可能與桃子品種及其果實中的果膠含量、果膠酶含量等因素有關。

2.3 多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶活性與甲醇含量的相關性

2.3.1 兩個品種桃果實中的多聚半乳糖醛酸酶活性

由圖2可知，不同時期的倉方早生PG活性呈先下降后升高的趨勢，其中M1的PG活性最高，為（0.57±0.03）mg/（h·g）；不同時期的中華壽桃PG活性也呈先下降后升高的趨勢，其中Z1的PG活性最高，為（0.61±0.01）mg/（h·g），高于M1時的PG活性。可以看出，PG活性隨著采摘時期的延長，其酶活性略有下降，但是到果實完全成熟后又略有回升，其回升的原因可能與果實的軟化有關[16]。

圖2 不同品種桃子果實的多聚半乳糖醛酸酶活性Fig.2 Polygalacturonase activity of different varieties of peach fruit samples

2.3.2 多聚半乳糖醛酸酶活性與相應蒸餾酒中甲醇含量的相關性

對兩個品種桃果實中的PG活性與相應蒸餾酒中的甲醇含量進行相關性分析，結果見表3。由表3可知，倉方早生PG活性與中華壽桃PG活性具有極顯著的正相關性（P＜0.01），且倉方早生PG活性與甲醇的含量成極顯著的正相關性（P＜0.01），可以推測無論品種是否一樣，甲醇的產生可能與果實中PG活性有關，PG活性高，加快了果膠的分解，進而甲醇產生的可能性就越大。

表3 兩個品種桃果實中多聚半乳糖醛酸酶活性與相應桃蒸餾酒中甲醇含量的相關性Table 3 Correlation of polygalacturonase activity in two varieties of peach fruits and methanol contents in corresponding peach distilled liquor

2.3.3 兩個品種桃果實中的果膠酯酶活性

測定不同編號的桃果實中的PE活性，結果見圖3。由圖3可知，3個不同時期的倉方早生PE活性先降低后有所回升，其中M1的PE活性最高，為（1.26±0.12）U/g，M2的PE活性最低，為（0.63±0.05）U/g；3個不同時期的中華壽桃的PE活性逐漸降低，其中Z1的PE活性最高，為（0.63±0.08）U/g，Z3的PE活性最低，為（0.28±0.02）U/g。可見，隨著果實的成熟，PE的活性逐漸降低，這是因為在未成熟階段，果膠與纖維素結合在一起形成不溶的原果膠，因而果膠以一種被保護的形式存在，此時果膠酯酶的作用底物少，因而活性相對較弱，而隨著果實的成熟，原果膠逐漸被分解，此時可溶性果膠越來越多，果膠酯酶的活性也逐漸增強。KETSA S等[17]研究了榴蓮中的PE活性，在較成熟階段榴蓮中PE活性高于不太成熟的階段，與該試驗結果一致。總體來看，3個不同時期的倉方早生的PE活性都高于中華壽桃的PE活性，而圖1中倉方早生蒸餾酒中的甲醇含量也普遍高于中華壽桃蒸餾酒中甲醇的含量，且PE活性與甲醇含量具有顯著相關性（P＜0.01）。

圖3 不同品種桃子果實樣品的果膠酯酶活性Fig.3 Pectinesterase activity of different varieties of peach fruit samples

2.3.4 果膠酯酶活性與相應蒸餾酒中甲醇含量的相關性

對兩個品種桃果實中的PE活性與相應蒸餾酒中的甲醇含量進行相關性分析，結果見表4。由表4可知，倉方早生PE活性與中華壽桃PE活性呈極顯著相關性（P＜0.01），且中華壽桃PE活性與甲醇含量也呈極顯著正相關性（P＜0.01）。由此可以推出，兩個品種的桃蒸餾酒中甲醇含量差異大的原因與果實中的PE活性直接相關，PE活性越強，甲醇含量越高。

表4 兩個品種桃果實中果膠酯酶活性與相應桃蒸餾酒中甲醇含量的相關性Table 4 Correlation of pectinesterase activity in two varieties of peach fruits and methanol contents in corresponding peach distilled liquor

2.4 兩個品種桃果實中果膠物質含量與相應蒸餾酒中的甲醇含量的相關性

2.4.1 倉方早生桃果實中可溶性果膠含量和原果膠含量

對倉方早生果實中的果膠含量進行測定，結果見圖4。由圖4可知，M1、M2、M3中可溶性果膠含量逐漸升高，其中M3的可溶性果膠含量最高，為（54.20±0.44）μg/mL；原果膠含量普遍偏低，且隨著果實的成熟逐漸呈下降的趨勢，其中M1時原果膠含量最高，為（24.46±0.27）μg/mL；可能是由于原果膠隨著采摘時期的延長及果實的成熟，逐漸分解為可溶性果膠，使得原果膠含量下降，可溶性果膠含量上升，這與胡留申等[18]研究結果一致，其表明果實的成熟伴隨著原果膠的降解和可溶性果膠含量的上升。M1、M2、M3中總果膠含量逐漸升高，其中M3的總果膠含量最高，為（2.02±0.33）μg/mL。

圖4 倉方早生桃果實中的果膠含量Fig.4 Pectin content in Cangfangzaosheng peach fruit

2.4.2 倉方早生桃果實中果膠物質含量與相應蒸餾酒中甲醇含量的相關性

對倉方早生果實中的果膠含量與甲醇含量進行相關性分析，結果見表5。由表5可知，倉方早生中可溶性果膠含量、原果膠含量和總果膠的含量與甲醇含量無顯著的相關性（P＞0.05），而可溶性果膠含量與原果膠含量呈極顯著的負相關性（P＜0.01），與總果膠含量呈極顯著的正相關性（P＜0.01）。

表5 倉方早生桃果實中果膠含量與甲醇含量的相關性Table 5 Correlation of between pectin content and methanol content in Cangfangzaosheng peach fruit

2.4.3 中華壽桃果實中可溶性果膠含量和原果膠含量

中華壽桃果實中的果膠含量測定結果見圖5。由圖5可知，Z1、Z2、Z3中可溶性果膠含量逐漸升高，其中M3含量最高，為（30.56±0.42）μg/mL；原果膠含量逐漸降低并趨于穩定，其中Z1的原果膠含量最高，為（59.86±0.78）μg/mL，且Z1、Z2、Z3的總果膠含量差值變化不大，呈現先降低后升高的趨勢。中華壽桃的原果膠含量普遍高于可溶性果膠含量，這可能與桃子的品種有關，雖然Z1、Z2、Z3的成熟度逐漸增大，但是不同的采摘時期其相應的果實硬度沒有明顯的變小，這可能是因為原果膠通常與纖維素結合在一起，使細胞間粘附性和緊湊性加強，所以原果膠含量變化差異小導致果實硬度變化也相應小。綜合圖4和圖5來看，倉方早生桃果實中M1、M2、M3中可溶性果膠含量遠遠高于中華壽桃Z1、Z2、Z3中可溶性果膠的含量，而圖1中倉方早生蒸餾酒中甲醇含量普遍高于中華壽桃蒸餾酒中的甲醇含量，考慮兩個品種蒸餾酒中甲醇含量差異大的原因之一是果實中可溶性果膠含量的不同，可溶性果膠含量高，果實中的果膠酯酶活性相對也高，則分解果膠產生甲醇的可能性也越大。REVILLA I等[19]研究表明，果實中的果膠酯酶主要分解可溶性果膠，使其發生脫脂反應，之后去甲基化的果膠被PG進行酶促分解，導致果膠聚合度降低。

圖5 中華壽桃果實中的果膠含量Fig.5 Pectin content in Zhonghuashoutao fruit

2.4.4 中華壽桃果實中果膠物質含量與相應蒸餾酒中甲醇含量的相關性

對中華壽桃果實中的果膠含量與甲醇含量進行相關性分析，結果見表6。由表6可知，中華壽桃中可溶性果膠含量與原果膠含量呈極顯著的負相關性（P＜0.01），且可溶性果膠與甲醇含量也呈極顯著的負相關性（P＜0.01），而總果膠含量與甲醇含量無顯著的相關性（P＞0.05），原果膠含量與甲醇含量呈極顯著的正相關性（P＜0.01）。

表6 中華壽桃果實中果膠含量與甲醇含量的相關性Table 6 Correlation between pectin content and methanol content in Zhonghuashoutao fruit

2.5 模擬發酵試驗結果分析

對不同添加處理的發酵液中的甲醇含量進行測定，結果見圖6。由圖6可知，2-1號發酵液中的甲醇含量明顯低于2-2號發酵液中甲醇的含量，其含量分別為（3.92±0.17）g/L和（5.18±0.34）g/L，與1號空白對照相比，含有果膠及果膠酶的培養基中甲醇含量明顯較高，且在果膠添加量相同的情況下，添加果膠酯酶含量高的果膠酶其相應的發酵液中甲醇含量相對較高；3-1號和3-2號添加的果膠含量不同，果膠添加量分別是5 g/L和10 g/L，其對應發酵液中的甲醇含量分別為（4.24±0.21）g/L和（6.85±0.08）g/L，很明顯，3-2號發酵液中甲醇含量高于3-1號中的，說明在果膠酶含量一定時，添加的果膠含量越多，發酵液中甲醇含量也越多，且添加的果膠為桃子中提取的可溶性果膠，由此也可以看出，可溶性果膠含量越高，相應產生的甲醇含量也越高；4-1號和4-2號添加的果膠類型不同，分別添加的是高脂果膠和低酯果膠，其對應的發酵液中的甲醇含量分別是（4.28±0.16）g/L和（7.96±0.24）g/L，可以發現添加高脂果膠的發酵液中的甲醇含量最高，遠高于1號對照組及其他處理組，這說明不僅果膠的含量會影響甲醇的含量，果膠的酯化度對甲醇含量也有一定的影響，果膠的酯化度高，即果膠的甲基酯含量較高，果膠酶進行分解時，會釋放更多的甲基，在果膠酶的作用下生成更高的甲醇，由此可以推出，倉方早生蒸餾酒中的甲醇含量遠遠高于中華壽桃蒸餾酒中的，其一部分原因可能是因為倉方早生果實的酯化度大于中華壽桃果實的酯化度，導致其相應蒸餾酒中甲醇含量的明顯差異。

圖6 不同試驗處理發酵液的甲醇含量Fig.6 Methanol content in fermentation broths with different test treatments

3 結論

倉方早生蒸餾酒中的甲醇含量分別為（5.11±0.28）g/L、（2.98±0.36）g/L、（4.51±0.45）g/L，均明顯超出國家標準范圍2 g/L，而中華壽桃蒸餾酒中的甲醇含量分別為（0.61±0.18）g/L、（0.41±0.01）g/L、（0.21±0.02）g/L，符合國家對蒸餾酒中甲醇含量的要求。研究結果表明，兩個品種桃蒸餾酒甲醇含量差異大，其主要與兩個品種桃果實的PG活性、PE活性及果實中的果膠含量有關。通過相關性分析得出，桃果實中的PG活性和PE活性與與甲醇含量呈極顯著的正相關性（P＜0.01），PG活性和PE活性越高，果膠的分解越多，相應蒸餾酒中甲醇含量越高；而果實中總果膠含量與甲醇含量無直接相關性。由果實中可溶性果膠含量的差異得出，可溶性果膠含量越高，相應蒸餾酒中甲醇含量也越高。且模擬發酵試驗表明，甲醇含量的高低確實與果膠酶的含量及可溶性果膠的含量有關。