酸性茯苓多糖的提取工藝優化

李曉潔，曾百慧，陳慕蘭，郭毓菲，張詩泉，向 福，吳 鵬*

（黃岡師范學院 生命科學學院 經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）別稱茯苓塊、茯苓皮，屬真菌界，多孔菌科[1-2]。它作為滲濕利水的藥物，有消腫、安神和提高人體免疫力等功能[3-4]，茯苓多糖是茯苓的重要成分，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑，在防輻射和抗衰老方面有一定的療效[5]，其中酸性茯苓多糖占其多糖總量的80%以上。當前，人們對茯苓多糖的研究已經越來越深入，不再僅僅滿足于其基本功效，國內利用它抗腫瘤、增加免疫力的功效[6]，國外利用其功效，將其作為抗癌劑，投入市場[7]。然而，雖說對茯苓多糖的研究已經取得了很大的突破，但還是存在茯苓多糖提取效率低、成本高、活性機理研究尚不清楚等問題。

提取茯苓多糖[8]的方法有很多，有復合酶法[9]、熱水浸提法[10]、微波輔助提取法[11]及發酵法[12]等。復合酶法提取效果較好，但對于各種酶之間的協同效應以及最優酶解條件要求極高；熱水浸提法和發酵法時間長且提取率都較低；微波輔助提取法提取率高，但需控制溫度及時間。本研究采用堿提法提取茯苓多糖，操作容易，成本低廉，適用于大規模工業生產。選擇料液比、堿濃度、堿提時間為影響因素，通過單因素及響應面試驗對茯苓多糖提取工藝進行優化，旨在探索酸性茯苓多糖的最佳提取工藝，為更好的利用茯苓多糖提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓：市售；氫氧化鈉（分析純）、碳酸氫鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；乙二胺四乙酸（分析純）鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；C21-SK2103多動能電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；101-2A型電熱鼓風干燥機：天津泰斯特儀器有限公司；DFT-200C高速萬能粉碎機、FDU-1200真空冷凍干燥機：上海比朗儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：金壇市順華儀器有限公司；PH-10力辰科技筆式酸度計：杭州試三科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茯苓多糖提取工藝流程[13]及操作要點

茯苓粉的制備→堿液浸提→中和→離心→取沉淀透析→離心→取沉淀真空冷凍干燥→茯苓粗多糖

茯苓粉的制備：選用無斑點、無蛀蟲的茯苓，經清水洗凈后放入電磁爐中煮熟，將煮熟的茯苓烘干（50℃、24 h）、經粉碎機粉碎后過50目篩[14]得茯苓粉，封存，備用。

堿液浸提：稱取1 g茯苓粉放入燒杯，分別按照一定的料液比加入一定濃度的NaOH溶液，在4℃[13]恒溫水浴鍋中浸提一定時間。

中和：將堿液浸提多糖溶液用0.5 mol/L的HCl進行中和，使pH值為7，避免多糖在稀堿條件下發生水解。

離心：將中和后的溶液在8000r/min條件下離心10min，去除濾液，得到多糖沉淀。

透析：多糖沉淀進行透析，其目的是將NaCl去除，24 h內需要置換2～3次自來水，在低溫條件下透析7 d。

離心：在8 000 r/min條件下離心10 min，去除水分，得到多糖沉淀。

真空冷凍干燥：多糖沉淀在-60～-50℃溫度條件下，真空冷凍2 h，在-50～10℃溫度條件下冷凍干燥10 h，即可得到茯苓粗多糖。

1.3.2 提取工藝優化單因素試驗

取1 g茯苓粉，按照不同料液比1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60（g∶mL），加入不同濃度（0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L）的NaOH溶液，在恒溫水浴鍋中進行浸提不同時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h），浸提后的溶液用0.5 mol/L的HCl中和，使得混合體由透明水狀變為半透明黏稠狀，8 000 r/min離心10 min，取沉淀。將沉淀放入透析袋中，在水中透析7 d，透析完畢后，離心出盡可能多的水，最后通過真空冷凍干燥進一步去除粗多糖中的水，使黏稠狀的多糖變為紙質狀的多糖。稱取多糖質量并計算粗多糖提取率，其計算公式如下：

1.3.3 提取工藝優化響應面試驗[15]

根據單因素的試驗結果，通過中心組合試驗Box-Behnken設計方案，以料液比（A）、堿液濃度（B）和堿提時間（C）為響應因子，茯苓粗多糖的提取率（Y）為響應值，進行3因素3水平響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對提取率的影響

圖1 料液比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on polysaccharides extraction rate

由圖1可以看出，料液比對多糖提取效果非常明顯，提取效果基本呈直線變化。料液比為1∶40～1∶55（g∶mL）時，多糖提取率由60.4%上升至68.9%，此階段提取率上升趨勢明顯；當料液比為1∶55（g∶mL）時，多糖提取率最大，為68.9%；當料液比＞1∶55（g∶mL）之后，多糖提取率趨于穩定。因此，選擇料液比1∶55（g∶mL）為宜。

2.1.2 堿液濃度對提取率的影響

圖2 堿濃度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of alkali concentration on polysaccharides extraction rate

由圖2可以看出，隨著堿液濃度的增加，茯苓多糖提取率也增加，在堿液濃度為0.5 mol/L時，多糖提取率為75.8%達到峰值，在堿液濃度＞0.5 mol/L之后，茯苓多糖的提取率開始下降。多糖的提取大多都是采用稀堿溶液提取，因為這樣有利于使多糖中的不溶性纖維素、半纖維素等與果膠多糖之間的鍵斷裂，從而提高多糖產率，而堿液濃度過高的話，會破壞多糖結構，反而不利于提取，而且堿濃度過高，需要更多的酸來進行中和，成本也會增加。因此，NaOH溶液濃度0.5 mol/L為宜。

2.1.3 堿提時間對提取率的影響

圖3 堿提時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of alkali extraction time on polysaccharides extraction rate

由圖3可以看出，堿提時間為0.5～1.0 h時多糖提取率逐漸升高，并且多糖提取率在堿提時間為1.0 h時達到最大值，為73.8%，而堿提時間為1.0～2.5 h時，提取率開始下降，分析原因是反應時間過長，茯苓中的多糖在堿性環境中結構發生了變化，導致降解，因此多糖提取率下降。因此，堿提時間1.0 h為宜。

2.2 響應面試驗優化茯苓多糖的提取工藝[16]

2.2.1 響應面試驗設計及結果

采用Box-Behnken試驗設計對酸性茯苓多糖的提取的3個顯著影響因素進行3因素3水平的響應面試驗分析，以茯苓粗多糖的提取率（Y）為響應值，3個影響因素包括料液比（A）、堿濃度（B）、堿提時間（C），響應面設計及結果與分析見表2。

表2 響應面試驗設計結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments design

參照表2進行試驗，軟件分析響應值是酸性茯苓多糖的提取率，利用Design-Expert軟件對表2進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程[17-18]：

對模型進行顯著性檢驗，結果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，此回歸方程P＜0.05，說明該模型顯著，失擬項P值為0.050 9＞0.05，不顯著，表明回歸方程具有顯著意義。且該模型相關系數R2=0.868 9，說明該回歸方程可以很好地顯現料液比、堿液濃度、堿提時間與提取率之間的真實關系。由表3還可以得出，模型中因素B對結果影響極顯著（P＜0.01）、二次項B2交互項BC均對結果影響顯著（P＜0.05），而因素A、C；二次項A2、C2；交互項AB、AC對結果影響不顯著（P＞0.05）；3個因素茯苓多糖提取率影響順序為B＞A＞C，即堿液濃度＞料液比＞堿提時間。

2.2.2 響應面分析

各因素的交互作用對茯苓多糖提取率影響的響應面及等高線如圖4所示。

圖4直觀的反映了影響酸性茯苓多糖提取率的3個因素兩兩交互作用，隨著料液比、堿液濃度和堿提時間的增加，提取率的含量呈先升高后下降的趨勢，在所采用的數值間均有極值出現。沿料液比（A）方向比堿提時間（C）的響應面坡度的坡度更陡，等高線也更密集，說明料液比對酸性茯苓多糖提取率的影響大于堿提時間，與方差分析結果一致；等高線呈扁平狀則表示兩因素交互影響較大，堿液濃度（B）對酸性茯苓多糖提取率的影響大于堿提時間（C），且兩因素交互作用明顯，符合方差分析的結果。

圖4 料液比、堿液濃度和堿提時間對多糖提取率交互影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between material to liquid ratio,alkali concentration and alkali extraction time on polysaccharides extraction rate

2.2.3 驗證試驗結果

由上述響應面分析法求得的最佳條件為料液比1∶50，堿濃度0.6 mol/L，堿提時間1.06 h，理論最佳茯苓多糖提取率為78.6%，考慮在實際操作上的方便性，將各因素修正為料液比1∶50（g∶mL），堿液濃度0.6 mol/L，堿提時間1.0 h，進行驗證試驗，通過3次平行試驗，發現實際提取率平均值為78.5%，與回歸方程預測值78.6%基本吻合，所以該結果有效。

3 結論

本實驗探索茯苓多糖的提取方法，為進一步優化酸性茯苓多糖的提取工藝提供新的參考。相關資料表明，堿濃度顯著影響茯苓多糖的提取效果，在查閱了多篇文獻并進行預實驗后得出了三個較為顯著的影響因素，因此選用堿濃度、堿提時間、料液比三個單因素進行單因素和響應面試驗，得出料液比1∶50（g∶mL），堿液濃度0.6 mol/L，堿提時間1.0 h，多糖提取率達到78.5%，為提取酸性茯苓多糖提供了更加快速有效的方法。