葡萄枸杞復合果醋發酵工藝的研究

李彩霞，張睿睿

（河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000）

葡萄為葡萄科葡萄屬木質藤本植物，其營養價值較高，富含鈣、鐵、鉀、鎂和胡蘿卜素、核黃素、維生素C（vitamin C，VC）、葡萄糖、果糖、酒石酸、草酸等多種礦物質元素和營養成分。具有抗病毒殺菌、抑制腫瘤、抗貧血、降低胃酸、抗動脈粥樣硬化、補益大腦和利尿消腫等保健功能；還具有緩解機體疲勞，降低血糖濃度，預防骨質疏松癥，降壓，抗氧化和美容等藥理作用[1]。枸杞是茄科枸杞屬植物，味甘、性平，屬于衛生部公布的藥食同源品種，在我國和其他的亞洲國家有超過2000年的種植和食用歷史[2]。其含有豐富的枸杞多糖、β-胡蘿卜素、維生素E（vitamin E，VE）、硒及黃酮類等抗氧化物質，有較好的抗氧化作用，此外還具有抗衰老、免疫調節、降血糖、降血脂等作用[3]。

果醋是用水果或果品的加工下腳料為主要原料，利用現代生物技術釀制而成的一種營養豐富、風味優良的酸味調味品，其兼有水果和食醋的營養，是集保健、食療等功能為一體的新型飲品[4]。飲用果醋對人體健康有一定好處，如果能利用多種果蔬，將其制成復合型果醋，可以使果醋的營養種類更為豐富，復合型果醋也將擁有更廣闊的市場前景[5]。本試驗以葡萄和枸杞為原料，采用液態發酵法釀制復合果醋，探討葡萄枸杞復合果醋適宜的發酵工藝，以期為葡萄枸杞復合果醋的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄：產于甘肅張掖；7號紅枸杞干果：產于甘肅白銀；白砂糖（食品級）：市售。活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸桿菌：濟寧玉園生物科技有限公司。

葡萄糖（分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司；體積分數95%的乙醇（分析純）：上海中秦化學試劑有限公司；瓊脂：天津市致遠化學試劑有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術有限責任公司；果膠酶（1.2×105U/g）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.2 儀器與設備

TQHZ-2002A大容量全溫度振蕩培養箱：太倉華美生化儀器廠；DHP-9272電熱恒溫培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海璽袁科學儀器有限公司；pH 510型精密pH計：上海安萊立思儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合果醋釀造工藝流程及操作要點[6]

原料選擇：葡萄和枸杞應選擇成熟、無病和無霉爛的果實。

葡萄汁的制備[7]：葡萄去梗后，破碎，并立即添加140mg/L H2SO3（以SO2計）防止氧化，同時加入30 mg/L果膠酶，并于低溫條件下浸漬48 h，備用。

枸杞汁的制備[8]：枸杞清洗，40～50℃水浸泡20～30 min，以1∶3（g∶mL）的比例加水破碎打漿、過濾，并在枸杞汁中加入30 mg/L果膠酶與70 mg/L H2SO3（以SO2計）混勻，低溫條件下浸漬48 h，備用。

調整糖度、pH值：葡萄汁和枸杞汁按1∶1（mL∶mL）混合后，使用白砂糖調節糖度為18°Bx，且在發酵剛剛開始的時候一次性加完[9]。之后用pH計測定果漿的初始pH值，加入適量的碳酸鈣或酒石酸進行降酸或增酸，以便達到預定pH值。

酵母的活化[10]：取一定量的活性干酵母，加入其質量5%的白砂糖以及20倍質量的水，攪拌均勻，置于35～40℃電熱恒溫水浴鍋中30 min，冷卻至28～30℃備用。

酒精發酵：將活化好的酵母（溫差不超過10℃）加入待發酵液中進行酒精發酵，發酵6～7 d，發酵期間定期測定酒精度、相對密度、溫度、可溶性固形物，當相對密度達到0.992～0.996時，終止酒精發酵，轉入醋酸發酵。

醋酸菌的活化[11]：保藏菌種先經斜面活化，32℃培養24 h后，轉入醋酸菌活化培養基中，4層紗布封口，32℃、120 r/min振蕩進行活化，24 h后得到醋酸菌種子液。

醋酸發酵：將醋酸菌種子液以一定的接種量接種于發酵液中進行醋酸發酵，放入恒溫振蕩培養箱中，在一定的溫度條件下培養一定的時間，定期測定酸度，至酸度不再上升時結束發酵，經過濾、澄清并于75℃滅菌20 min[12]得到成品復合果醋。

1.3.2 酒精發酵單因素試驗設計

分別選取初始pH值（3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）、發酵溫度（22℃、24℃、26℃、28℃、30℃）、酵母添加量（2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%）3個因素進行酒精發酵單因素試驗，以酒精度為考察指標。

在單因素試驗的基礎上設計L9（33）正交試驗，以初始pH值（A）、發酵溫度（B）、酵母添加量（C）為3個因素，以酒精度為考察指標，優化酒精發酵條件，正交試驗因素水平見表1。

表1 酒精發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcoholic fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸發酵單因素試驗設計

選擇發酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、發酵時間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、醋酸菌接種量（2%、4%、6%、8%、10%）3個因素進行醋酸發酵單因素試驗，以總酸（以醋酸計）含量為考察指標。

在單因素水平試驗的基礎上設計L9（33）正交試驗，以發酵溫度（E）、發酵時間（F）、接種量（G）為3個因素，以總酸含量為考察指標，優化醋酸發酵工藝條件，正交試驗因素水平見表2。

表2 醋酸發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

（1）感官指標測定

復合果醋的感官指標參照GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》規定的感官方法進行分析。

表3 復合果醋感官評價標準Table 3 Sensory evaluation standards of compound fruit vinegar

（2）理化及微生物指標測定

可溶性固形物：采用手持糖量計測定[13]；酒精度：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》執行，采用密度瓶法測定；總糖與還原糖：采用菲林試劑滴定法測定[14]；總SO2：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》執行，采用直接碘量法測定；總酸：按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中電位滴定法測定；菌落總數及大腸菌群：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》。

2 結果與分析

2.1 酒精發酵試驗

2.1.1 初始pH值對酒精發酵的影響

圖1 初始pH值對酒精發酵的影響Fig.1 Effect of initial p H value on alcoholic fermentation

初始pH值低于3.8時，酒精度隨初始pH的升高而逐漸上升，pH過低，不利于酵母菌的活動，酵母生長緩慢，產酒精量較少，此時提高pH值，可以提高酒精發酵產物的量；初始pH為3.8時，酒精度達到最大，為8.25%vol；初始pH值繼續增大，酒精度下降，是由于酸度過低，抑制酵母菌的生長繁殖，不利于酒精發酵，造成發酵不徹底，產酒精率下降，甚至會使發酵失敗。因此，選擇酒精發酵的最佳初始pH值為3.8。

2.1.2 發酵溫度對酒精發酵影響高而逐漸升高，是因為酵母菌生長對溫度敏感，升高溫度能加快酵母菌生長繁殖[16]；發酵溫度為28℃時，酒精度達到最高，為8.19%vol，繼續升高發酵溫度，會導致酒精度下降，是由于高溫對酵母菌生長不利，使酵母提前出現疲勞狀態而抑制酒精發酵，發酵提前終止，酒精度較低[17]。因此，選擇酒精發酵最適溫度為28℃。

2.1.3 酵母添加量對酒精發酵的影響

由圖3可知，酵母添加量為2.0%～6.0%時，酒精度隨酵母添加量增加而逐漸升高；酵母添加量為6.0%時，酒精度達到最高，為8.15%vol；繼續增大酵母添加量酒精度反而降低，可能是由于在酒精發酵前期，酵母過多，會產生大量的酒精，導致酵母菌生長受到抑制，酒精度增加緩慢，產酒精量相對較低[15]。因此，選擇酒精發酵最適酵母添加量為6.0%。

圖3 酵母添加量對酒精發酵的影響Fig.3 Effect of yeast addition on alcoholic fermentation

2.2 酒精發酵工藝優化

酒精發酵工藝優化正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

表4 酒精發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for alcoholic fermentation conditions optimization

圖2 發酵溫度對酒精發酵的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on alcoholic fermentation

由圖2可知，發酵溫度為22～28℃時，酒精度隨溫度升

表5 酒精發酵條件優化正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results for alcoholic fermentation conditions optimization

從表4、表5可知，3個因素的主次關系依次為初始pH值、發酵溫度、酵母添加量。顯著性檢驗表明，初始pH值對酒精發酵的影響為極顯著水平（P＜0.01）；溫度對酒精發酵為顯著水平（P＜0.05）；酵母添加量對酒精發酵影響不顯著（P＞0.05）。最優的工藝組合為A3B2C2，即初始pH值為4.0，發酵溫度為28℃，酵母添加量為6%。在此條件下進行驗證試驗，測得發酵液中酒精度為8.28%vol，表明優化的工藝條件穩定。

2.3 醋酸發酵單因素試驗

2.3.1 發酵溫度對醋酸發酵的影響

圖4 發酵溫度對醋酸發酵的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation

由圖4可知，在一定溫度范圍內，醋酸菌的生長繁殖隨發酵溫度的升高而增加，果醋中總酸含量隨發酵溫度升高而逐漸上升，當發酵溫度為30℃時，總酸含量達到最大，為3.30 g/100 mL；當發酵溫度升高到一定程度，菌體容易老化，醋酸菌的生長代謝受到阻礙，醋酸含量下降[18]。因此，選擇30℃為醋酸發酵的最適發酵溫度。

2.3.2 發酵時間對醋酸發酵的影響

在一定時間范圍內，發酵液中酸含量隨發酵時間的延長而逐漸上升，發酵時間為5 d時，發酵液中總酸含量達到最大，為3.52 g/100 mL；發酵時間繼續延長，總酸含量幾乎保持不變，是由于醋酸菌在繁殖初期數量少，隨時間延長醋酸菌大量繁殖，乙酸含量上升，發酵后期，由于產物抑制作用導致酸含量不再增加，發酵液中酸含量幾乎保持不變[19]。因此，選擇醋酸發酵最適時間為5 d。

圖5 發酵時間對醋酸發酵的影響Fig.5 Effect of fermentation time on acetic acid fermentation

2.3.3 接種量對醋酸發酵的影響

隨著接種量增大，果醋中總酸含量上升，接種量過低，醋酸菌濃度低，產酸速率慢，提高接種量可使產酸速度加快[20]；接種量為4%時，總酸含量達到最大，為3.70 g/100 mL；繼續增加接種量，由于醋酸菌含量過高，導致發酵后期營養物質不足，影響醋酸菌生長發酵能力，不利于醋酸的積累，產酸速度減緩。因此，選擇醋酸菌最適接種量為4%。

圖6 接種量對醋酸發酵的影響Fig.6 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

2.4 醋酸發酵工藝優化

醋酸發酵工藝優化正交試驗結果見表5。

表5 醋酸發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

續表

由表5可知，在試驗號為1、4、5、8的工藝條件下發酵的果醋，總酸含量均低于3.5 g/100 mL，不符合果醋釀造的國家標準。

從極差分析中可以看出，在醋酸發酵階段3個影響因素的主次順序為發酵時間＞發酵溫度＞接種量。可見，在醋酸發酵工藝中，對這3個因素而言，發酵時間最為重要，其次是發酵溫度，接種量對產酸量影響不顯著。最優的工藝組合為E3F3G2，即發酵溫度為32℃，發酵時間為6 d，醋酸菌接種量為4%。在此條件下進行驗證試驗，測得復合果醋中總酸含量為4.27 g/100 mL。

2.5 產品質量指標

2.5.1 感官指標結果

色澤：紅茶色，有光澤；香氣：有枸杞特有的果香味、醋香；葡萄水果的混合香味，香味濃郁協調；滋味：口感柔和甘爽，酸甜適中，無澀味，無不良氣味；體態：體態澄清透明，無沉淀和懸浮物。

2.5.2 理化指標

總酸（以醋酸計）：4.27 g/100 mL；還原糖（以葡萄糖計）2.5 g/L；SO2：125 mg/L。以上指標均符合國家標準。

2.5.3 微生物指標

菌落總數≤50 CFU/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌：未檢出。

3 結論

以葡萄和枸杞為原料，通過酒精發酵和醋酸發酵兩個階段的試驗，研究復合果醋的最佳生產工藝，結果表明，酒精發酵的最佳工藝條件為酵母添加量6.0%、初始pH值為4.0、發酵溫度為28℃，發酵時間6 d；醋酸發酵的最佳工藝條件為醋酸菌接種量4.0%，發酵溫度32℃，發酵時間6d。此條件下制得的葡萄枸杞復合果醋呈紅茶色，有光澤；有葡萄、枸杞特有的果香味、醋香，葡萄水果的混合香味，香味濃郁協調；口感柔和甘爽，酸甜適中，無澀味，無不良氣味；體態澄清透明，無沉淀和懸浮物。總酸（以醋酸計）為4.27 g/100 mL，還原糖（以葡萄糖計）為2.5 g/L，工藝條件穩定。