黑曲霉泡騰片制備工藝優化

唐婧紅，范可帷，張 素，陳 雪，李 祝*，代園鳳，張欽語，楊佩斯，趙妗頤，吉玉玉

（1.貴州省煙草公司畢節市公司，貴州 畢節 551700；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.四川省雙流棠湖中學，四川 成都 610200；4.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

農藥泡騰劑是一種相對較新、發展較晚的特殊劑型[1]。它是由崩解劑（酸源和堿源）和各組分固體顆粒、粉體混合，經造粒或直接壓制而成的藥劑，它在水中能迅速崩解產生大量的CO2[2]。崩解后農藥活性成分向周圍擴散，這些活性成分接觸到靶標作物后，能有效地發揮除草、殺蟲或殺菌等方面的活性作用[3]。目前泡騰片在生產上的制備方法主要有5種，分別為酸堿分開濕法制粒[4]﹑干法制粒[5]﹑酸堿混合非水制粒[6]﹑直接壓片和聚乙二醇包裹法[7]。泡騰片在醫療和飲用方面以有了廣泛的使用，但在農藥運用上時間并不長[8]。

雖然已有報道通過黑曲霉（Aspergillus niger）發酵液防治煙草青枯病[9]。但利用的是黑曲霉的代謝產物進行抑菌作用，而本研究是利用黑曲霉孢子粉進行抑菌作用，制備一種活菌泡騰片。黑曲霉孢子粉具有易貯藏、保藏費用低、可便于運輸、不易污染、環境適應性強、直接投入發酵、發酵再生能力強等優勢[10-11]。這種泡騰劑在使用時具有攜帶方便、省時、省力和高效等特點[12]。泡騰劑具有獨特的優越性，符合現在農藥劑型的發展趨勢[13]。

因此，本研究采用粉末直接壓片法制備黑曲霉泡騰片，以崩解時限、pH值、發泡量為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗，對黑曲霉泡騰片的工藝參數進行優化，為將來黑曲霉的發展奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）：貴州大學生命科學學院微生物教研室，保藏于中國典型培養物保藏中心（Chinacenter for type culture collection，CCTCC）），保藏號CCTCCNO：M206021。

1.1.2 試劑

檸檬酸（分析純）：江蘇強化功能化學股份有限公司；碳酸氫鈉（分析純）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、可溶性淀粉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HPD-101-2A電熱鼓風恒溫干燥箱：常州市華普達教學儀器有限公司；YP-30手動液壓壓片機：鶴壁市創新儀器儀表有限公司；PHS-3C型酸度計：上海大普儀器有限公司；78X-Z型片劑四用測定儀：上海黃海藥檢儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉泡騰片的制備工藝

采用粉末直接混合壓片法制備黑曲霉泡騰片。

技術要點：

（1）黑曲霉固態發酵物在65℃鼓風干燥箱中干燥24 h，粉碎，收集備用。

（2）將PEG乙醇溶液加入碳酸氫鈉后混勻烘干，烘干溫度低于60℃，避免溫度過高碳酸氫鈉受熱分解。

（3）將含有PEG 6000溶液的碳酸氫鈉烘干粉碎后，加入酒石酸、黑曲霉孢子粉和粘合劑，壓片前須將原料和輔料充分混勻，避免壓出的泡騰片顏色不均勻。

1.3.2 黑曲霉泡騰片制備工藝優化單因素試驗

（1）泡騰片崩解劑種類及比例的確定

泡騰崩解劑由酸源和堿源組成[14]，常用的酸源有檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等；常用的堿源有碳酸氫鈉、碳酸鈉﹑碳酸鈣等[15]。而酸源和堿源的選擇會影響泡騰片的崩解時間、發泡量等。通過預實驗對泡騰劑種類進行初步篩選。結果表明碳酸鈣產氣效果不好且在水中有沉淀，因此選用碳酸氫鈉作為堿源。

選取黑曲霉孢子粉的添加量為10%，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）乙醇溶液質量分數為10%，添加量為7 g/mL，PEG 6000乙醇溶液質量分數為10%，添加量為3.15 g/mL，可溶性淀粉作為填充劑，碳酸氫鈉作堿源，因為蘋果酸吸濕性較強，所以分別以檸檬酸和酒石酸為酸源，采用粉末直接壓片法制備黑曲霉泡騰片，以外觀、黏沖情況為評價指標，選擇最適酸源。

在選擇最佳酸源的基礎上，選擇泡騰片崩解劑（酒石酸∶碳酸氫鈉）比例為1.00∶1.00、1.00∶1.20、1.00∶1.25、1.00∶1.50，按粉末直接混合壓片法制備黑曲霉泡騰片，測定其崩解時限及發泡量。

（2）潤滑劑種類及質量分數的確定

分別以PEG 6000乙醇溶液、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮為潤滑劑制備黑曲霉泡騰片，其他條件不變，觀察泡騰片外觀，選擇最適潤滑劑。

在選擇最佳潤滑劑的基礎上，選用最佳潤滑劑質量分數分別為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的PEG 6000乙醇溶液進行試驗，觀察泡騰片黏沖情況。

（3）粘合劑質量分數的確定

預試驗表明，蔗糖溶液吸濕性較大，所以選用PVP粘合劑。選擇聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液的質量分數為2.5%、5%、7.5%，按上述方法制備泡騰片，觀察壓片時模具的黏沖和泡騰片的外觀。

（4）崩解劑添加量的確定

選擇崩解劑的添加量為60%、65%、70%制備黑曲霉泡騰片，觀察壓片情況并測定其崩解時限。

（5）黑曲霉孢子粉添加量的確定

預試驗表明，黑曲霉孢子粉的添加量會影響泡騰片的崩解時限，所以，需要選擇合適的孢子粉添加量。選擇黑曲霉孢子粉的添加量為10%、15%、20%、25%、30%，以外觀和崩解時限為評價標準，確定泡騰片中孢子粉添加量的范圍。

1.3.3 黑曲霉泡騰片制備工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取影響較大的3個因素崩解劑比例（A）、黑曲霉孢子粉添加量（B）、崩解劑的添加量（C）為考察因素，崩解時間為評價指標，選擇L9（34）正交試驗設計進行3因素3水平的正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 黑曲霉泡騰片制備工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for preparation process optimization of Aspergillus niger effervescent tablets

1.3.4 檢測分析方法

（1）發泡量的測定[16]

取一只燒杯，加200 mL水，投入泡騰片1 g，立即將所產生的氣體導入一倒立、充滿水的100 mL量筒中，至不再有氣體產生時，記錄量筒中氣體的體積，即為發泡量。

（2）崩解時限的檢查[17]

取1片泡騰片（3.5 g/片）于含200 mL水的250 mL燒杯中，水的溫度為（25±5）℃。把泡騰片放入水中開始計時，等完全崩解時終止計時，即為崩解時限。同法檢查6片，各片均應在5 min內崩解。如有1片不能完全崩解，應另取6片復試，均應符合2015版《中國藥典》規定。

（3）pH值測定

取泡騰片3片，分別分散于100mL 20℃蒸餾水中，測定各溶液的pH值，結果取平均值。

（4）硬度測定[17]

取3片制得的泡騰片，采用片劑四用測定儀檢查泡騰片硬度，將泡騰片放入儀器中，轉動100次，取出，減失質量≤1%。如減失質量＞1%，應復測2次，均應符合2015版《中國藥典》規定。

1.3.5 統計分析

使用SPSS v18.0數據統計軟件對結果進行分析（n=3）。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉泡騰片制備工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 泡騰片酸源的確定

以檸檬酸和酒石酸為酸源，制備黑曲霉泡騰片，觀察其外觀和黏沖情況，結果見表2。

表2 不同酸源制得的泡騰片的評價Table 2 Evaluation of effervescent tablets produced by different acid sources

由表2可知，酒石酸作為崩解劑的酸源時，表面較光滑且黏沖不明顯，而檸檬酸作為崩解劑的酸源時，表面凹凸不平且黏模。因此選擇酒石酸為最優酸源。

2.1.2 泡騰片崩解劑配比的確定

以酒石酸為泡騰片的酸源，碳酸氫鈉為泡騰片的堿源，選取不同的崩解劑配比（酸堿比），測定其發泡量（CO2體積）與崩解時限，結果見表3。

表3 崩解劑配比對泡騰片發泡量和崩解時限的影響Table 3 Effect of disintegrating agent ratio on foaming amount and disintegration time-limit of effervescent tablets

由表3可知，隨著酸堿比例的增大，發泡量先增多后減少，崩解時限先減小后增大。崩解劑的發泡量多、崩解時限短時，崩解劑較好。因此，崩解劑的最優配比為1.00∶1.20。

2.1.3 潤滑劑種類的確定

用硬脂酸鎂作為潤滑劑，崩解劑溶解后有明顯不溶物；用聚乙烯吡咯烷酮出片較順利但崩解劑吸濕性較強；用PEG 6000所得顆粒較均勻，壓片后溶解，未見不溶物。綜合考慮，選擇PEG 6000乙醇溶液作為潤滑劑。

2.1.4 PEG 6000質量分數的確定

潤滑劑PEG6000質量分數對泡騰片的影響結果見表4。

表4 潤滑劑質量分數對泡騰片的影響Table 4 Effect of lubricant mass fraction on effervescent tablets

由表4可知，當潤滑劑PEG 6000質量分數為10%時，所得泡騰劑的外觀最好，且無黏沖現象，因此潤滑劑最優質量分數是10%。

2.1.5 粘合劑質量分數的確定

PVP乙醇溶液質量分數對泡騰片的影響結果見表5。

表5 粘合劑質量分數對泡騰片的影響Table 5 Effect of binder mass fraction on effervescent tablets

由表5可知，添加質量分數為2.5%的PVP乙醇溶液時，片劑粘合較好、出片順利且吸濕現象不明顯。因此，選擇PVP乙醇溶液的最佳質量分數為2.5%。

2.1.6 崩解劑添加量的確定

選擇不同崩解劑的添加量，測定其崩解時限，結果見表6。

表6 崩解劑添加量對泡騰片崩解時限的影響Table 6 Effect of disintegrating agent addition on disintegration time-limit of effervescent tablets

由表6可知，隨著崩解劑添加量的增加，崩解時間由56s變成52 s，崩解時限變短，所以選擇崩解劑添加量為65%。

2.1.7 黑曲霉孢子粉添加量的確定

不同的黑曲霉孢子粉添加量對泡騰片外觀及崩解時限的影響結果見表7。

表7 黑曲霉孢子粉添加量對泡騰片的影響Table 7 Effect of Aspergillus niger spore powder addition on effervescent tablets

由表7可知，隨著黑曲霉孢子粉添加量的增加，崩解時限也隨之增加。因此，選擇孢子粉添加量為10%。

2.2 黑曲霉泡騰片制備工藝優化正交試驗

2.2.1 正交試驗結果與分析

以崩解劑比例（A）、孢子粉添加量（B）、崩解劑添加量（C）為評價因素，崩解時限為評價指標，進行正交試驗，結果與分析見表8，崩解時限的方差分析結果見表9。

表8 黑曲霉泡騰片制備工藝優化正交試驗設計及結果Table 8 Design and results of orthogonal experiments for preparation process optimization of Aspergillus niger effervescent tablets

表9 以崩解時限為評價指標的正交試驗結果與方差分析Table 9 Results and variance analysis of orthogonal experiments using disintegration time-limit as evaluation index

由表9可以看出，以崩解時限為評價指標時，因素對崩解時限影響的主次順序為B＞A＞C，即孢子粉添加量＞崩解劑比例＞崩解劑添加量，孢子粉添加量對崩解時限影響最大（P＜0.05），最優組合為A3B3C3，即酒石酸和碳酸氫鈉比例為1.00∶1.25、孢子粉添加量為15%、崩解劑添加量為70%。

2.2.2 驗證試驗

用正交試驗得出的最優配比A3B3C3制作泡騰片進行驗證試驗，得出黑曲霉泡騰片的pH為5.7，崩解時限為23 s，發泡量為40.79 mL/g，硬度（4.3 kg），優于其他試驗組。

3 結論

在單因素試驗基礎上，經正交試驗得出黑曲霉泡騰片的最優制備工藝條件為酒石酸與碳酸氫鈉的比例1.00∶1.25，崩解劑的添加量70%，孢子粉添加量15%，質量分數為10%的聚乙二醇6000乙醇溶液為潤滑劑、添加量為3.15 g/mL，質量分數為2.5%的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液為粘合劑、添加量為7 g/mL。在此最優工藝條件下，制備的黑曲霉泡騰片pH為5.7、黏沖現象不明顯，崩解時限（23 s）、發泡量（40.79mL/g）、硬度（4.3 kg），均符合2015版《中國藥典》[17]的規定。