左旋奧拉西坦在腦缺血再灌注模型大鼠體內的藥動學研究

利 玲，胡 秀，利 莉 （1.鄂東醫療集團黃石市中心醫院，湖北理工學院附屬醫院，湖北 黃石 435000；2.腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435000）

奧拉西坦是一種臨床上用于治療認知障礙、記憶障礙、缺血性中風和癡呆的益智藥[1-2]。通過與谷氨酸受體的相互作用，奧拉西坦可以選擇性作用于大腦皮層和海馬，保護、激活或促進神經細胞功能的恢復，積極調節神經遞質的興奮過程，而藥物本身沒有直接的血管活性，也沒有中樞興奮作用，對學習記憶能力的影響是一種持久的促進作用[3-4]。此前有研究探討奧拉西坦對實驗動物和細胞的保護作用，結果顯示僅有奧拉西坦的左旋體表現出活性[5-6]。在谷氨酸的存在下，左旋奧拉西坦刺激Ca2+被攝取到小腦，并呈現劑量依賴性，而右旋奧拉西坦是無效的[7-8]。盡管奧拉西坦的活性具有立體選擇性，目前臨床常用的仍為奧拉西坦的消旋混合物。由于機體的生物選擇性和潛在的對映體相互轉化，藥物對映異構體可能有不同的藥代動力學、毒理學和藥效學特性。因此闡明奧拉西坦對映異構體中具有活性的左旋奧拉西坦在正常大鼠及腦缺血再灌注模型大鼠體內的藥代動力學特性具有重要意義。

本文應用高效液相色譜法（HPLC）建立了大鼠血漿中左旋奧拉西坦濃度的測定方法，探討左旋奧拉西坦在正常大鼠及腦缺血再灌注模型大鼠體內藥代動力學規律，旨為左旋奧拉西坦的藥代-藥效（PK-PD）研究和臨床應用的合理性及安全性提供重要參考依據。

1 材料

1.1 儀器

日立L-7000型高效液相色譜系統，配有L-7110型泵，L-7200型自動進樣器，L-7420型UV檢測器；Vortex-5型渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS110S型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；高速低溫離心機（美國Thermo Scientific公司）；KQ 500DE型數控超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

左旋奧拉西坦（純度＞ 99%，深圳斯坦德化工科技有限公司）；茴拉西坦（純度＞ 98.5%，北京萬佳首化生物科技有限公司）；HPLC級乙腈和HPLC級甲醇均購自美國天地高純溶劑有限公司；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠，體質量230 ～ 270 g，購自北京維通利華動物實驗中心，實驗動物合格證號為SCXK（京）2014-0016。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[9-10]

色譜柱為APS-2 HYPERSIL柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為水-乙腈（12 : 88，v/v），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長214 nm，柱溫25 ℃。

2.2 標準溶液的配制

精密稱取左旋奧拉西坦適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為20 mg·L-1儲備液，臨用前用甲醇稀釋成濃度為5、20、100、500、750、1000 μg·mL-1的標準系列溶液，同法配制質控樣品的標準溶液，濃度分別為10、400、800 μg·mL-1。

精密稱取內標適量，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1000 μg·mL-1的標準溶液。

2.3 血漿樣品處理

取100 μL血漿，加入10 μL內標溶液和300 μL甲醇，充分渦旋振蕩，14 000 r·min-1離心10 min；將上清全部移入另一干凈EP管中，采用氮氣吹干儀將甲醇吹干完全，加入100 μL甲醇進行復溶，再次充分渦旋振蕩，14 000 r·min-1離心10 min，取上清20 μL進樣分析。

2.4 動物模型建立

本實驗采用改良Zea Longa線栓法[11]制作大腦中動脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。待大鼠麻醉后，使其仰臥并固定在手術平板上，頸部備皮并消毒；在頸部正中稍偏右切口，分離皮下和肌肉組織，使頸總動脈暴露；剝離頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）；用手術線結扎ECA，CCA的近心端，并在CCA的遠心端備線用于止血，使用動脈夾夾住ICA遠心端；在CCA剪一“v”形口，將尼龍線栓插入CCA內，將尼龍線栓沿ICA管腔緩慢送入顱內，直至送至大腦中動脈（MCA）的起始端，線栓入顱的長度應距離ECA和ICA的分叉處約18 mm，將止血線收緊；手術傷口采用以生理鹽水浸濕的紗布覆蓋，并保持在37 ℃和一定的濕度；40 min后緩慢拔出尼龍線栓，結扎止血線；皮膚縫合。

參照Zea Longa 5分制評分方法對手術后2 ～ 4 h的動物神經行為學進行評分[12]。0分：無神經功能損傷；1分：輕微神經功能缺損，不能完全伸展對側前爪；2分：對側前肢卷曲；3分：輕度向對側轉圈；4分：嚴重向對側轉圈；5分：對側偏癱。選取2分～ 3分的腦缺血再灌注模型大鼠于術后24 h進行實驗。

2.5 藥代動力學實驗[13-14]

采用生理鹽水將左旋奧拉西坦配制成3 mg·mL-1的溶液，并用0.22 μm的濾膜過濾，用于大鼠的尾靜脈注射。12只SD大鼠隨機分為兩組，即正常對照組和腦缺血再灌注模型組，每組6只，兩組大鼠以15 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射給予左旋奧拉西坦，于給藥前及給藥后2、5、15、30、45、60、90、120、240 min通過大鼠眼眥靜脈取血250 μL置于肝素化EP管中，以4500 r·min-1離心15 min，分離出100 μL血漿，按“2.3”項下方法操作，進樣20 μL分析。

2.6 數據處理

藥代動力學參數采用DAS 2.0軟件計算，兩組大鼠參數的統計采用SPSS 20.0計算，組間比較采用t檢驗進行分析，以P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 分析方法的確證

3.1.1 專屬性 在“2.1”色譜條件下，左旋奧拉西坦和內標的保留時間分別為5.12 min和6.19 min，空白血漿、空白血漿中加入左旋奧拉西坦和內標、大鼠給藥后的血漿樣品色譜圖見圖1，實驗結果表明左旋奧拉西坦和內標的測定不受血漿中的內源性物質干擾。

3.1.2 標準曲線的制備及定量下限 分別取空白血漿90 μL，加入10 μL左旋奧拉西坦系列標準溶液，配制成相當于左旋奧拉西坦濃度為0.5、2.0、10.0、50.0、75.0、100.0 μg·mL-1的血漿樣品溶液，按“2.3”項下方法操作，以左旋奧拉西坦濃度（X）為橫坐標，左旋奧拉西坦和內標的峰面積比值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得相應的回歸方程Y = 0.359 5 X + 2.532，r2=0.996 8，權重因子W = 1/X2。定量下限為0.5 μg·mL-1（S/N≥ 10）。質控樣品的血漿樣品溶液同法配制，濃度分別為1、40、80 μg·mL-1。

圖1 大鼠血漿色譜圖注：A -空白大鼠血漿，B -空白大鼠血漿+左旋奧拉西坦（0.5μg·mL-1）+內標，C -大鼠靜注左旋奧拉西坦后1 h血漿；1 - 左旋奧拉西坦，2 - 內標Fig 1 Chromatograms of plasma in ratNote: A- blank rat plasma, B - blank rat plasma + S-oxiracetam(0.5 μg·mL-1) + internal standard, C - plasma sample 1 h after administration of S-oxiracetam to a rat; 1 - S-oxiracetam, 2 - internal standard

3.1.3 提取回收率 按“3.1.2標準曲線的制備及定量下限”項下操作配制質控血漿樣品（1、40、80μg·mL-1，n = 3），按“2.3血漿樣品處理”項下操作，進樣分析得到左旋奧拉西坦血漿樣品峰面積A。另用甲醇配制成左旋奧拉西坦的標準溶液（10、400、800 μg·mL-1），除不加入空白血漿外，其余操作同“3.1.2標準曲線的制備及定量下限”項下操作，每個濃度平行做3份，進樣分析得到左旋奧拉西坦血漿樣品峰面積B。左旋奧拉西坦的回收率為A/B的平均值×100%，結果三濃度質控樣品的回收率分別為（97.4 ± 5.3）%、（98.3 ± 4.1）%、（96.0 ± 6.8）%，回收率均大于90%，且在待測濃度范圍內，樣品低、中、高濃度的回收率穩定（RSD ＜ 15%），符合生物樣品分析要求。

3.1.4 精密度和準確度 實驗樣品為質控樣品（n =6），按“2.3血漿樣品處理”提取處理后進樣，測定日內和日間變異，隨行標準曲線計算其濃度，并與理論濃度比較計算其準確度。結果見表1，所有樣品的日內RSD和日間RSD均小于15%，同時低、中、高3個濃度準確度在85% ～ 115%范圍內，符合生物樣品分析要求。

3.1.5 穩定性 實驗樣品為質控樣品（n = 6），分別考察室溫放置6 h、- 20 ℃冰箱凍存10 d和進樣倉放置12 h的穩定性。按“2.3血漿樣品處理”提取處理后進樣，三種條件下的測得值和理論值無顯著性差異，顯示樣品在上述儲存條件下穩定，詳見表1。

表1 精密度、準確度和穩定性結果. n = 6Tab 1 Results of precision, accuracy and stability. n = 6

3.2 藥代動力學結果

在主要藥動學參數中，正常對照組大鼠和腦缺血再灌注模型組大鼠的AUC0-t、AUC0-∞、MRT0-t、t1/2z、CLz和Vz具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。推斷由于腦缺血再灌注模型組大鼠的病理狀態導致了藥物在體內的代謝速率減慢，清除率降低，平均駐留時間延長，所得的平均藥-時曲線和主要藥動學參數見圖2和表2。

4 討論

4.1 檢測波長的確定

圖 2 大鼠靜注左旋奧拉西坦后的平均血藥濃度-時間曲線. n = 6,Fig 2 Plasma concentration-time profile of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

表2 大鼠靜注左旋奧拉西坦后的主要動力學參數. n = 6Tab 2 Pharmacokinetic parameters of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

表2 大鼠靜注左旋奧拉西坦后的主要動力學參數. n = 6Tab 2 Pharmacokinetic parameters of S-oxiracetam following single intravenous administration in rats. n = 6,

注：與正常對照組比較，*P ＜ 0.05Note: compare with the normal group, *P ＜ 0.05

參數 正常對照組 模型組AUC0-t/μg·mL-1·min-1 734.5 ± 193.8 1391.3 ± 403.8*AUC0-∞/μg·mL-1·min-1 772.7 ± 199.7 1436.9 ± 410.4*MRT0-t/min 27.1 ± 12.4 50.5 ± 17.8*t1/2z /min 34.6 ± 14.5 59.7 ± 18.1*CLz /L·min-1·kg-1 0.02 ± 0.009 0.01 ± 0.004 Vz /L·kg-1 3.1 ± 1.0 0.8 ± 0.3*Cmax /μg·mL-1 38.1 ± 25.6 35.0 ± 20.1

從左旋奧拉西坦結構看出其紫外吸收較弱，通過紫外掃描發現，該化合物僅在210 nm波長處附近有較強吸收。雖考慮到210 nm與甲醇的最大截止波長205 nm比較接近，造成基線的擾動可能較大，但是為得到更高的靈敏度，通過固定相和流動相的優化，選擇214 nm作為檢測波長，左旋奧拉西坦和內標物的吸收度相對均較大，色譜峰尖銳、穩定，可用于定量。

4.2 內標物的選擇

本研究選擇左旋奧拉西坦的結構類似物茴拉西坦作為內標，該化合物穩定性良好，價廉易得，便于推廣使用。在本實驗的色譜條件下，內標物和被測物得到了良好的分離，提高了實驗的準確度，可以用于生物樣品中左旋奧拉西坦的定量檢測。

4.3 前處理方法確定

本研究探索了幾種血漿樣品前處理的方法，包括有機溶劑直接沉淀法，液液萃取法等。直接沉淀法會對血漿樣品進行稀釋，大大降低了方法的靈敏度，無法成功用于大鼠體內的左旋奧拉西坦的藥動學研究；由于左旋奧拉西坦化合物的極性較大，采用常規的乙酸乙酯萃取法會顯著降低方法的回收率。因此，本研究采用甲醇沉淀蛋白后，吹干，再用小體積甲醇復溶的方法，簡便易行，且提高了靈敏度。

4.4 色譜柱的選擇

由于左旋奧拉西坦的極性較大，采用普通C18色譜柱時保留時間太短，本研究通過不斷實踐，采用氨基柱作為固定相，得到了合適的左旋奧拉西坦和內標物的保留時間和分離度。

4.5 臨床意義

本研究首次根據左旋奧拉西坦的理化性質對色譜柱的填料類型、流動相的組成及配比、紫外檢測波長等條件進行了摸索，最后采用了高效液相色譜法建立了大鼠血漿中左旋奧拉西坦的濃度測定方法，該法操作快速簡便，方法穩定，適用于大鼠體內的左旋奧拉西坦藥物代謝動力學研究，以及其它相關的研究。左旋奧拉西坦在大鼠體內代謝迅速，本研究采用腦缺血再灌注模型大鼠進行藥代動力學研究，通過比較發現，正常組大鼠和腦缺血再灌注模型大鼠的藥代動力學參數具有顯著性的差異，腦缺血再灌注模型組大鼠較正常組大鼠藥-時曲線下面積增加，消除速率減慢。因此該藥物在臨床應用于腦缺血再灌注病人時，應該注意其劑量的設計，從而保證藥物在臨床應用過程中的安全性和有效性。當然由于人類和大鼠的種屬差異明顯，左旋奧拉西坦在患者體內的藥代動力學特征仍需要進一步評估。