2D-LC/UV法測定苯妥英血藥濃度的臨床應用

院江麗，張寒娟，袁冬冬 （.鄭州市第七人民醫院藥學部，河南 鄭州 45006；2.新鄉醫學院藥學院，河南 新鄉 453003）

苯妥英是一種傳統的抗癲癇藥物，因其療效顯著，且鎮靜作用輕微，目前仍是全面強直陣攣發作的一線選用藥物[1]。由于苯妥英具有飽和性藥代動力學特點，而且治療窗很窄，安全范圍小，易發生血藥濃度過高引起的毒性反應，故需要進行血藥濃度監測來保證其治療的安全性和有效性[2]。

隨著現代分離分析技術的快速發展，二維色譜技術受到了體內藥物監測越來越多的關注和重視[3]。二維色譜能使樣品組分在兩個不同的分離條件下進行分離，顯著提高了分離能力，降低了色譜峰重疊，同時改善了色譜峰鑒定的可靠性。本研究探索二維液相色譜法在抗癲癇藥苯妥英血藥濃度監測方面的應用，并對實驗的方法學進行驗證，旨為藥學工作者掌握新的藥物監測方法提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

2D-LC/UV系統由島津LC-20AT液相色譜部件和FLC 2420全自動二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）構成；TDZ4-WS低速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；Mini-15K微型高速離心機（杭州奧盛儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；GH-202電子分析天平（日本AND公司）；醫用冰箱（合肥美菱股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

苯妥英（批號：BZ150712，含量：99.0%，中國食品藥品檢定研究院）；VCV-1D移動相，BPI-1堿性流動相，API-1酸性流動相，MPI-1移動相，ACP-1去蛋白劑，ACG保護劑（均購于湖南德米特儀器有限公司）；空白馬血清；純水為怡寶純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

第一維色譜系統中，色譜柱：Aston SC2柱（4.6 mm×25 mm，5 μm），流動相為VCV-1D移動相（20.0 mmol·L-1磷酸銨-乙腈-甲醇= 3 : 1 : 1，磷酸調pH值至5.4），流速0.7 mL·min-1。捕集柱：Aston SH柱（3.0 mm×10 mm，5 μm），流動相為純水。第二維色譜系統中，色譜柱：Aston SCB柱（4.6 mm×100 mm，5 μm），流動相為BPI-1堿性流動相∶API-1酸性流動相∶MPI-1移動相= 11∶37∶52（V∶V∶V），流速1.2 mL·min-1。柱溫：40 ℃，紫外檢測波長：240 nm，采用等度洗脫，進樣量50 μL。FLC2420系統測定流程：樣品通過自動進樣器進樣，在第一維色譜柱進行初步分離，樣品中目標組分轉移至捕集柱中，捕集柱中的目標組分在第二維流動相淋洗下進一步分離，被后端UV檢測器檢測。本實驗時間程序設置見表1。

表1 FLC2420系統運行時間程序Tab 1 Time program for online column extraction of FLC2420

2.2 標準儲備液的配制

精密稱取苯妥英對照品4.98 mg，用25%異丙醇水溶液溶解并定容至10 mL，得苯妥英對照品的標準儲備液，濃度為493.02 μg·mL-1，置- 20 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 血液樣品處理方法

血液樣品低速離心（3000 r·min-1）5 min備用；準確吸取900 μL ACP-1去蛋白劑（12%高氯酸）至1.5 mL的EP管中，再準確加入300 μL血清，渦旋振蕩1 min后，高速離心（14 500 r·min-1）8 min備用；再準確吸取100 μL ACG保護劑和1000 μL上清液至1.5 mL進樣瓶中，震蕩搖勻，備用。在“2.1”色譜條件下，進樣50 μL，記錄色譜圖和峰面積，采用外標工作曲線法定量，將樣品峰面積代入標準曲線，計算所得濃度。

2.4 色譜行為考察

在上述“2.1”色譜條件下，分別對空白血樣、空白血樣中加入對照品以及受試者服藥后的血樣進行測定，結果見圖1。由圖1可知，苯妥英的保留時間在6.30 min左右，峰形較好，血清中內源性雜質峰不干擾測定，專屬性較好。

圖1 2D-LC/UV色譜圖A - 空白血樣，B - 空白血樣+苯妥英對照品，C - 受試者服藥后的血樣；1 - 苯妥英Fig 1 2D-LC/UV chromatogramA - blank serum, B - blank serum + phenytoin, C - serum after taking phenytoin; 1 - phenytoin

2.5 線性關系考察

將苯妥英標準儲備液用空白馬血清稀釋成系列濃度溶液（1.54、3.08、6.16、12.33、24.65、49.30 μg·mL-1），按“2.3”項下方法處理并測定，以苯妥英的濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制工作曲線，得到線性回歸方程為Y = 7.173 4×103X +8.718 8×103（r = 0.999 9），定量下限質量濃度為1.54 μg·mL-1（S/N＞10）。臨床上苯妥英有效血藥濃度為10 ～ 20 μg·mL-1，當血藥濃度超過20 μg·mL-1易產生毒性反應，出現眼球震顫，超過30 μg·mL-1出現共濟失調，超過40 μg·mL-1往往出現嚴重毒性。由此可見，所選線性范圍包含其治療濃度參考范圍和實驗室危急值，可滿足臨床測定范圍的要求。

2.6 回收率和精密度

將苯妥英標準儲備液用空白馬血清稀釋成高、中、低（49.30、12.33、3.08 μg·mL-1）3個濃度的工作液，按血液樣品處理方法，在“2.1”色譜條件下測定3次，取平均值，代入標準曲線方程計算苯妥英的血藥濃度，以實測值與加入質量濃度之比計算回收率。每個濃度設置6組平行，分別在同一天內測定6次計算日內精密度和連續6日內每日測定1次計算日間精密度。由表2的結果可知，本方法的回收率高于94%，日內、日間的精密度RSD值均小于3.53%，符合生物等效性研究的方法學要求。

表2 方法回收率及日內日間精密度. n = 6Tab 2 The recovery and intra-day and inter-day precision. n = 6

2.7 樣品穩定性考察

將“2.6”項下的高、中、低濃度的工作液，分別在室溫下放置24 h、反復凍融3次以及- 20 ℃冰凍保存30 d后按血液樣品處理方法，在“2.1”色譜條件下，測定6次，取平均值。結果表明血漿中苯妥英穩定性良好，RSD均小于5%，詳見表3。

表3 樣品穩定性結果. n = 6Tab 3 The stability results of samples. n = 6

2.8 臨床應用

采集30例口服苯妥英鈉患者血清樣本進行血藥濃度檢測。要求首次服藥兩周后，下一次服藥前取靜脈血2 mL，按血液樣品處理方法，在“2.1”色譜條件下，測定苯妥英的血藥谷濃度。結果在治療窗濃度范圍（10 ～ 20 μg·mL-1）之內有19例，超過治療窗濃度范圍有6例，低于治療窗濃度范圍有5例，其中不在治療窗濃度范圍的患者占總人數的36.7%。

3 討論

苯妥英個體差異較大，一方面與其特殊的藥代動力學特征有關；另一方面與患者用藥依從性、服藥劑量、藥物相互作用、病理狀況、以及年齡存在很大的關聯[4]。不同的藥品生產廠家生物利用度也存在差異[5-6]，應關注這一情況。因此患者服用苯妥英達到維持劑量后、每次劑量調整后及更換藥品廠家后，都應當測定血藥濃度， 這不僅可以提高藥物治療效果，也可避免或減少藥品不良反應的發生。

目前苯妥英血藥濃度的測定方法[7]主要有色譜法、免疫法[8-9]和光譜分析法。高效液相色譜法因靈敏度、精密度高，專一性強，應用范圍廣，已成為血藥濃度監測中最常用的方法[10]。但該方法對樣品的前處理要求非常高，必須完全去除大分子蛋白質及其他大分子物質，以最大程度地減少對分析柱的柱效的影響。免疫法監測藥物濃度主要是利用蛋白競爭的原理進行監測的，這類方法樣品處理簡單，獲取結果快，但儀器和試劑盒依賴進口，價格昂貴。紫外分光光度法專屬性差，容易受血液中其它組分的干擾，單獨應用于測定血藥濃度時常常受到限制。

本研究采用的2D-LC/UV，該法是在單分離柱基礎上發展起來的，其技術關鍵是聯結兩色譜分離系統之間的接口設備和技術[11]。通過色譜柱的二次分離，大大減少血中雜質的干擾，提高了檢測結果的準確度；通過捕集柱的捕獲和富集，縮短了分析時間，實現了樣品的快速測定。采用該方法苯妥英單個檢測樣品可在7 min內測定完畢，提高了監測結果的反饋速度，有利于臨床醫師更好的指導合理用藥。

綜上所述，本研究建立的2D-LC/UV法測定苯妥英血藥濃度的方法，具有前處理簡單、自動化程度高、靈敏準確、快捷穩定等特點，能滿足臨床報告及時性、準確性和測定范圍等要求，可以作為臨床監測苯妥英血藥濃度的有效方法。