慢性乙肝患者的乙肝病毒大蛋白檢測(cè)的臨床價(jià)值

王曙光 滕義建 王芳

（江蘇豐縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 江蘇 徐州 221700）

目前臨床對(duì)HBV感染患者,通常采用血清學(xué)指標(biāo)如乙肝二對(duì)半、HBV-DNA和肝功能檢測(cè),來(lái)監(jiān)測(cè)HBV感染者的病情輕重、傳染性大小及評(píng)價(jià)抗病毒藥物療效等，但是由于e抗原敏感性較差，使得檢測(cè)結(jié)果很難真實(shí)反應(yīng)患者乙肝病毒活躍程度，而HBV-DNA檢測(cè)又受一定條件限制，也很難大規(guī)模開(kāi)展。近年隨著對(duì)HBV大蛋白(large sueface protein LP)在檢測(cè)HBV感染與復(fù)制及用于制備重組疫苗、藥物等方面的探究，使其作為新的和更有價(jià)值的、可靠的乙型肝炎抗病毒治療監(jiān)測(cè)的血清免疫學(xué)指標(biāo)之一，受到臨床廣泛關(guān)注，現(xiàn)各大醫(yī)院已常規(guī)開(kāi)展檢測(cè),我科目前也已開(kāi)展該項(xiàng)檢測(cè)。

1.材料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月—2016年12月在我院就診者，共120例慢性乙肝病毒患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病分會(huì)聯(lián)合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的慢性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男68例、女42例，年齡19～77歲之間。所有選擇對(duì)象留取血清2ml，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑

檢測(cè)儀器包括美國(guó)伯樂(lè)的洗板機(jī)和酶標(biāo)儀，廈門安普利熒光定量PCR儀，日立7600生化分析儀等。乙肝兩對(duì)半試劑由上海科華生物工程有限公司提供，廈門英科新創(chuàng)公司提供HBV-LP抗原與PreS1抗原檢測(cè)試劑，HBV-DNA定量檢測(cè)試劑由廈門安普利科技有限公司生產(chǎn)，肝功能檢測(cè)試劑購(gòu)自上海科華生物工程有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

乙肝兩對(duì)半檢測(cè)采用ELISA法，HBV-LP采用酶標(biāo)定性檢查,Pre-S1抗原采用 ELIS雙抗體夾心法檢測(cè)。以上檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，選擇波長(zhǎng)450nm通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定，讀取各孔OD值，并按說(shuō)明書(shū)要求設(shè)Cut off值，測(cè)定結(jié)果大于Cut off值為陽(yáng)性。采用熒光定量PCR法測(cè)定HBV-DNA，病毒載量單位以copies/ml表示，參考臨界值為5*102copies/ml。肝功能項(xiàng)目測(cè)定按照要求，用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，校準(zhǔn)品由試劑廠家提供，質(zhì)控品為伯樂(lè)公司提供。

1.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行處理，將所有有效數(shù)據(jù)輸入到Excel表中，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較組間差異，計(jì)量資料采用方差分析進(jìn)行比較組間差異， 將P＜0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

2.結(jié)果

2.1 120例慢性乙肝患者血清HBV-LP、HBV-DNA、Pre-S1和HBeAg陽(yáng)性例數(shù)與陽(yáng)性率見(jiàn)表1。

結(jié)果分析如下：HBV-LP與HBeAg陽(yáng)性率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=81.4，P＜0.05)；HBV-LP與HBV-DNA之間的結(jié)果差異不明顯(χ2=1.035，P=0.326)；HBV-LP與Pre-S1陽(yáng)性率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.3，P＜0.01)。

表1 慢性乙肝患者HBV.LP、HBV DNA、Pre—S1和HBeAg陽(yáng)性例數(shù)與陽(yáng)性率比較

2.2 75例HBeAg陽(yáng)性血清和35例HBeAg陰性血清的HBVLP與HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表2。

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽(yáng)性患者的HBV-LP陽(yáng)性率明顯高于HBeAg陰性患者，他們之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.2，P＜0.05)；HBeAg陽(yáng)性患者的HBV-DNA陽(yáng)性率則明顯高于HBeAg陰性患者的HBV-DNA結(jié)果，他們之間的差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.2，P＜0.05)；另外，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)無(wú)論HBeAg陽(yáng)性組或者HBeAg陰性組，HBV-LP與HBV DNA陽(yáng)性率之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.29，P＞0.05)。

表2 HBeAg陽(yáng)性和HBeAg陰性患者的HBV-LP與HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 HBV-LP各孔OD值結(jié)果與HBV-DNA拷貝數(shù)之間的相關(guān)性比較，見(jiàn)表3。

通過(guò)分析HBV-LP、Pre-S1各孔吸光度值（OD）值與HBVDNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)性。

表3 HBV-LP、Pre-S1A值與HBV-DNA拷貝數(shù)之間的結(jié)果比較

2.4 HBV-LP表達(dá)與肝功能各指標(biāo)間的結(jié)果比較，見(jiàn)表4。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，HBV-LP陽(yáng)性患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于HBV-LP陰性患者(P＜0.05），而總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、總膽紅素（T-BIL）水平之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 HBV-LP結(jié)果與肝功能各項(xiàng)指標(biāo)的比較

3.討論

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種傳染性病毒，對(duì)人類健康危害很大，感染后發(fā)展成慢性乙肝以致肝硬化肝的比率很大，因此人們對(duì)其重視程度越來(lái)越高，對(duì)其調(diào)查與研究亦日益增多。據(jù)報(bào)道當(dāng)前全球范圍內(nèi)有4億人左右是慢性乙型肝炎病毒攜帶者，其中75%感染者分布在在亞洲和西太平洋地區(qū)。在中國(guó)，乙型肝炎是高發(fā)區(qū)，乙型肝炎病毒的攜帶率占總?cè)丝诘?0.3%左右 ，另外由于流動(dòng)性人口的不斷增加，乙肝病毒攜帶者的人數(shù)亦不斷上升。這其中約有10%的乙肝患者轉(zhuǎn)化為慢性肝炎[1]。而慢性肝炎患者可以從無(wú)癥狀到隱性癥狀到漸漸變?yōu)閲?yán)重的慢性肝損傷如肝硬化以及肝細(xì)胞癌。據(jù)報(bào)道25%一40%乙肝病毒感染者將發(fā)展為肝硬化和肝癌[2]，對(duì)患者健康威脅很大乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）是病毒形成完整外膜的重要標(biāo)志，其包含PreS1、PreS2和S三個(gè)結(jié)構(gòu)域，與病毒復(fù)制密切相關(guān)[3]。因此，對(duì)乙肝病毒各個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，及時(shí)采取治療措施具有十分重要的意義。

HBV作為傳染性疾病之一，在我國(guó)屬于危害比較重的一種疾病，目前臨床判斷乙型肝炎患者病毒是否存在復(fù)制的常用指標(biāo)是Hear以及HBV-DNA，它們反映了人體對(duì)乙型肝炎病毒的免疫反映狀態(tài)以及所秉承的轉(zhuǎn)化過(guò)程，也是判斷患者傳染性及預(yù)后情況的傳統(tǒng)指標(biāo)。但臨床發(fā)現(xiàn)，一部分HBeAg陰性患者依然存在乙肝病毒的大量復(fù)制，并且HBV-DNA檢測(cè)條件要求高，質(zhì)量控制嚴(yán)格，有的醫(yī)院并不是每天都檢查，這使其檢測(cè)特別在基層醫(yī)院難以普及。

研究證明，乙肝病毒大蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[4]，它是構(gòu)建Dane顆粒包膜蛋白和管狀顆粒的重要成分。乙肝病毒大蛋白具有雙幣-拓?fù)鋵W(xué)構(gòu)像，面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔的Pre-S區(qū)可以介導(dǎo)成熟病毒顆粒與細(xì)胞吸附，而面向細(xì)胞質(zhì)的Pre-S區(qū)在病毒組裝中發(fā)揮相關(guān)功能，同時(shí)大蛋白的Pre-S2區(qū)具有與蛋白激酶C相互作用啟動(dòng)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[5]。肝細(xì)胞內(nèi)的乙肝病毒大蛋白積累過(guò)多可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急反應(yīng)，可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，這可能與HBV-LP促進(jìn)CAPN2、eIF3K及PPP2CB表達(dá)促發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。肝細(xì)胞損傷后釋放乙肝病毒顆粒到血液中去，使患者血清中檢測(cè)到HBV—LP成為可能。本報(bào)告研究發(fā)現(xiàn)HBV-LP與HBV-DNA有明顯相關(guān)性，提示HBV—LP的結(jié)果表達(dá)與病毒的復(fù)制有關(guān)，這為臨床判斷病毒復(fù)制與否提供新的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。另外在慢性乙肝患者中，HBV-LP與HBV-DNA兩者之間檢出結(jié)果無(wú)明顯差異，但明顯高于Pre-S1和HBeAg陽(yáng)性率。由此可知，HBV-LP相比Pre-S1能更加真實(shí)地反映出病毒的復(fù)制情況，其在臨床的應(yīng)用有更大的價(jià)值。

通過(guò)對(duì)患者的肝功能分析發(fā)現(xiàn)，HBV-LP陽(yáng)性患者的ALT、AST水平高于HBV-LP陰性患者，由于ALT和AST是反映肝細(xì)胞損傷極為靈敏的指標(biāo)，提示HBV-LP的表達(dá)與肝細(xì)胞損傷有關(guān)。

通過(guò)進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者的HBV-DNA拷貝數(shù)與HBV-LP平均OD值之間具有良好的相關(guān)性，說(shuō)明HBV-LP在基層醫(yī)院不具備HBV-DNA檢測(cè)的情況下，可以作為替代檢測(cè)指標(biāo)。

總之，HBV-LP檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，且與HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果有良好的相關(guān)性，同時(shí)HBV-LP的表達(dá)與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這表明HBV—LP的檢測(cè)可稱為預(yù)測(cè)肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的新指標(biāo)，是慢性乙肝檢測(cè)指標(biāo)的有益補(bǔ)充。乙肝兩對(duì)半與HBV—LP的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于臨床判斷病情 選擇最佳治療方案 檢測(cè)病情變化和觀察臨床療效具有重要的意義。