復合SDF-1的PLGA材料促進大鼠骨髓間充質干細胞增殖和遷移初探

姜楊 李永濤 徐桂清 郭林娜 張彧婷 沈雷 姚立杰 王玉

（1齊齊哈爾醫學院解剖學教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（2齊齊哈爾醫學院基礎醫學院 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（3齊齊哈爾醫學院細胞生物學教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

引言

目前，組織工程技術的快速發展，早已成為許多學者研究的熱點，但組織工程學修復損傷肌腱的研究還是很少。肌腱損傷治療還停留在傳統的治療手段上，如縫合、移植等，治療后也會出現肌腱重復斷裂，對患者造成精神和身體上一定痛苦。隨著組織工程技術的開展，有些學者提出組織工程手段修復損傷肌腱，為治療肌腱損傷提供一個新的治療方法。姜任武等[1]將MSCs培養在支架上，放于跟腱損傷部位，8周后復合物與肌腱融合，無瘢痕形成。本實驗研究選取的種子細胞為骨髓間充質干細胞，支架材料為PLGA高分子材料。

骨髓間充質干細胞（BMSCs）是目前組織工程最理想的種子細胞，獲得容易，來源于骨髓，屬于來源發育早期中胚層一類成體干細胞，優點具有多向分化性特性和自我更新能力，其取材方便，能在體外貼壁、增殖生長的細胞。很多學者通過實驗研究得出間充質干細胞在一定誘導條件下可以分化成軟骨細胞、成骨細胞、成脂肪細胞，促進損失組織愈合作用[2]。目前研究乳酸-乙醇酸（PLGA）是目前理想的生物組織支架材料，其特點具有生物相容性、降解性好以及較好的力學性能，應用在納米醫學范疇內[3]。在高分子生物支架上加入緩釋一定濃度趨化因子SDF-1，趨化因子是細胞因子家族中小分子蛋白質，具有趨化作用的[4]。SDF-1（又稱CXCL12），屬于趨化家族中的一員，有學者研究：與配體CXCR4結合成生物軸，形成CXCL12∕CXCR4軸，其軸是調控間充質干細胞向損傷部位遷移發揮重要作用[5]。CXCL12∕CXCR4軸同時增加間充質干細胞生存活性及增殖等作用[6]。本實驗通過組織工程手段研究趨化因子SDF-1復合PLGA支架材料，觀察骨髓間充質干細胞種植在復合支架上的增殖和趨化能力。

1.材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清（美國Gibco），DMEM培養基（美國HyClone），青鏈霉素（美國Gibco），胰蛋白酶（Sigma 公司），4%多聚甲醛，大鼠SDF-1（美國Abcam），PLGA（上海聚睿生物公司）。

超凈工作臺，二氧化碳恒溫細胞培養箱，倒置顯微鏡（日本Olympus），Transwell小室（美國Corning），CCK-8試劑盒（碧云天）Emax 酶標儀為（美國 Molecular Devices），高速離心機（德國Eppendorf），震蕩儀（躍進儀器廠），靜電紡絲機（SS-2535DC）。

1.2 大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養：取2～4周齡SD大鼠（齊齊哈爾醫學院動物中心提供），體重100g左右，斷頸處死，分離股骨，無菌環境下處理取大鼠股骨兩端剪開，3mlPBS培養基沖洗骨髓腔1～2次，離心管收集細胞懸液1000r/s，離心5～10min，用槍頭吸出上清液，加入培養液，用培養液吹均勻離心管下層組織，放入25cm2培養瓶培養，放入37℃，5%CO2細胞培養箱內，12～24h觀察換液，觀察細胞培養瓶有霧狀細胞聚集，慢慢去除未貼壁細胞，之后每3d進行換液。倒置顯微鏡觀察細胞形態、狀態，細胞長滿培養瓶底80%～90%進行消化和傳代，第三代間充質干細胞應用進行實驗研究。

1.3 聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料制備

將PLGA材料溶于六氟異丙醇和冰醋酸溶液中，制備3%比重聚合物溶液，在室溫下放在攪拌器上，用磁力棒攪拌，混勻，一般24小時左右。打開靜電紡絲機電源預熱，推注器選用2.5ml注射器，噴絲直徑0.5mm，速度0.6mL∕h，電極距離12cm，鋁箔接收后放入干燥箱內，-80℃保存。

1.4 緩釋SDF-1的納米材料制備

殼聚糖緩釋SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，并進行紫外照射滅菌。

1.5 將BMSCs加入緩釋SDF-1的納米材料

將4×105個BMSCs滴加到緩釋SDF-1聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料上，37℃，5%CO2細胞培養箱培養，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 培養各組細胞（BMSCs對照組、BMSCs+PLGA組、緩釋SDF-1復合PLGA生物纖維肌腱+BMSCs組）24小時，提取各組細胞上清液。

1.7 CCK8實驗檢測各組BMSCs細胞增殖能力

按照CCK-8試劑盒說明書進行操作，取對數生長期的BMSCs細胞，取將第三代間充質干細胞用胰蛋白酶消化1～2min，計數細胞，實驗組取1×105個MSC滴加到殼聚糖緩釋SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，對照組取1×105cells/mL密度直接接種于96孔板，每孔加入培養液200μL，放入37℃、5%CO2培養箱培養1天等待貼壁，給予換液，每組設5個復孔。分別在第1天、3天、5天棄掉原培養液，加入CCK-8溶液10μl，培養4小時，使用酶標儀在450nm波長下檢測各孔吸光度（OD值），取5孔平均值作為各組實驗結果。

1.8 Transwell實驗檢測各組細胞體外遷移的影響

按照Transwell試劑盒說明書進行操作，將第三代骨髓間充質干細胞用0.25%胰蛋白酶消化1～2min，細胞計數器調整骨髓間充質干細胞密度1×105個/mL，取細胞懸液200μL加入Transwell小室的上室，下室分別為500μLDMEM含120ng/ml濃度SDF-1因子復合PLGA上清液的培養液和含PLGA上清液的培養液，對照組為500μL的DMEM培養液，每組設3個復孔，37℃，5%CO2培養箱內培養12h，培養結束后4%多聚甲醛固定20min，0.1%結晶紫染色20min，在倒置顯微鏡下觀察，每個復孔隨機選取5個視野進行拍照統計穿膜細胞數。

1.9 統計學分析

實驗所有數據使用SPSS18.0軟件統計學分析，結果以（±s）表示，配對樣本進行t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 各組CCK-8細胞增殖實驗比較

BMSCs對照組、BMSCs+PLGA組、緩釋SDF-1復合PLGA材料+ BMSCs組，各組間充質干細胞活性的影響。結果S-BP實驗組細胞活性比BP組細胞活性增強（P＜0.01），BP組細胞活性比正常對照組細胞活性增強（P＜0.05），具有統計學意義，見表。

表 各實驗組BMSCs吸光度(OD值)的比較（±s，n=3）

表 各實驗組BMSCs吸光度(OD值)的比較（±s，n=3）

與正常對照組相比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 1d 3d 5d正常對照組 0.49±0.03 0.62±0.02 0.68±0.01 BP 組 0.59±0.02* 0.71±0.05* 0.78±0.04*S-BP 組 0.68±0.03* 0.83±0.04** 0.89±0.02**

2.2 各組細胞Transwell遷移實驗比較

S-BP實驗組與正常對照組比較有顯著性差別（P＜0.01），BP組與正常對照組相比較有明顯差別（P＜0.05）；具有統計學意義，見圖。

圖 各實驗組BMSCs遷移數量作用的比較（±s，n=3）與正常對照組相比較*P＜0.05，**P＜0.01。

3.討論

隨著現代體育運動熱潮的盛行，許多人都加入體育活動中。但是，由于鍛煉的方式不恰當或者年齡限制等許多因素，導致肌肉、肌腱損傷或斷裂的病例越來越多。據統計全球報道每年超過3000萬肌腱損傷案例[7]。目前傳統的治療方式主要是理療、縫合以及自體或同種異體移植、人工合成材料等，但治療愈后效果不理想。隨著社會科技不斷進步，醫學治療手段飛速發展，近年來，許多研究者運用干細胞復合生物支架材料的組織工程手段，加速了損傷肌腱等組織愈合再生[8]。

本研究實驗的種子細胞是取材方便、成活率高的大鼠成體骨髓間充質干細胞，BMSCs免疫原性低，分化能力強，是理想的組織工程種子之一。生物支架是生物相容性、降解性好和力學性能好的PLGA高分子材料，可以安全應用于人體內[9]。細胞因子也是組織工程不可缺少的重要組成部分，本實驗選擇在前期研究的趨化家族因子SDF-1，對間充質干細胞有趨化作用，趨化因子SDF-1與CXCR4結合，激活下游蛋白，招募間充質干細胞歸巢到損傷部位，參與修復組織。本實驗研究利用趨化因子殼聚糖緩釋120ng/ml濃度SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，再加入一定計數BMSCs放入支架進行聯合培養，來觀察BMSCs在復合SDF-1的PLGA材料支架上相容性和BMSCs增殖及遷移情況。實驗研究結果得出SDF-1因子和BMSCs可粘附在PLGA支架材料，說明PLGA支架材料無毒性；BMSCs在支架上形態呈梭形，生長情況較好，與PLGA支架材料相容性好。CCK-8增殖檢測S-BP實驗組細胞活性比BP組細胞活性增強（P＜0.01），BP組細胞活性比正常對照組細胞活性增強（P＜0.05）；Transwell細胞遷移實驗表明細胞遷移率S-BP實驗組與正常對照組比較有顯著性差別（P＜0.01），BP組與正常對照組相比較有明顯差別（P＜0.05）；復合SDF-1的PLGA支架材料可有效的使骨髓間充質干細胞增殖和遷移。進而我們可以推測出SDF-1趨化因子復合PLGA支架能夠使BMSCs增殖并且趨化使BMSCs至損傷肌腱位置，也參與損傷肌腱修復，也為下一步實驗的開展提供了實驗鋪墊。

綜上所述，利用組織工程技術促進肌腱組織修復已經成為日益重視的研究領域，復合型生物肌腱材料促進損傷肌腱的修復、再生及血管化是目前很多學者即要解決的問題，本研究通過構建復合SDF-1的PLGA材料支架有效趨化BMSCs遷移，但SDF-1趨化因子復合PLGA支架材料招募BMSCs歸巢的機制尚不清楚，還需進一步研究證實。