從羅非魚皮中提取與純化非變性膠原蛋白的方法的研究

王月林 何蘭 郭休玉 陸雪榮

（上海市水產(chǎn)研究所水產(chǎn)品加工與飼料研究室 上海 200433）

天然高分子膠原來源廣泛，可以從陸生動物如豬、牛的皮、骨、腱等部位獲取，也可以從水生動物中如魚皮鱗中獲取。由于陸生生物安全性問題日益受到人們的關注，很多國家和地區(qū)都限制了陸生生物來源膠原蛋白制品的使用范圍，而水生生物的皮、骨、鰭等含豐富的膠原蛋白, 被國內外學者認為是安全的膠原蛋白來源。本項目組以水產(chǎn)加工廢棄物羅非魚皮為原料，通過原料前處理、膠原提取、膠原純化等方法的研究，探討羅非魚皮非變性膠原蛋白的產(chǎn)業(yè)化路線。

1.材料與方法

1.1 原料前處理

1.1.1 從水產(chǎn)養(yǎng)殖廠購買新鮮羅非魚皮，清洗去鱗取皮，去除附著魚肉和魚鰭，切成2cm*2cm小塊，備用。

1.1.2 適量濃度的NaCl溶液清洗魚皮，料液比1∶10（w/v），4 ℃以下，每隔12hr更換一次溶液，重復4次。

1.1.3 再更換0.1mol/L的NaOH溶液清洗魚皮，料液比1∶10（w/v）4℃以下，每隔12hr更換一次堿液，重復4次，再用去離子水反復清洗至pH6.5～7。

1.2 提取粗膠原

1.2.1 酸溶性膠原的提取 將前處理后的魚皮放入0.5mol/L的乙酸溶液中，料液比1∶20（w/v），緩慢攪拌6hr后，過濾，取上清。重復上述酸溶步驟一次，合并濾液獲得酸溶性膠原ASC（acid-soluble collagen）。

1.2.2 酶溶性膠原的提取 1.2.1中過濾所得濾液中加入0.2%的胃蛋白酶，4℃酶解48hr，即獲得胃蛋白酶水解膠原PSC（pepsine-soluble collagens）。

1.3 膠原的純化

1.3.1 分級過濾 將酶溶性膠原溶液經(jīng)多次膜過濾，去除少量雜質。

1.3.2 鹽析 將濾液里加入飽和NaCl溶液至終端濃度為4%，靜置4hr，4℃離心30min，10000g，取沉淀的膠原。

1.3.3 透析 將鹽析獲得的膠原沉淀重新溶于純水或稀酸中，控制適當?shù)牧弦罕龋p微攪拌(80rpm)，裝入100KD截留分子量的透析袋中，透析外液為純水。

1.3.4 凍干 將經(jīng)透析純化的膠液用-60℃冷凍干燥機凍干。

1.4 得率計算

2.實驗結果與討論

魚皮的表皮起源于外胚層，魚皮薄而柔軟，角質化程度低，魚皮的前處理與陸棲動物不同。魚皮組織結構比較松散，脂肪和色素的含量較高，且不同種的魚皮的組織結構、色素脂肪有較大差異，所以加工工藝有所不同。魚皮中的結構蛋白主要為膠原蛋白，占80%以上，還有少量彈性蛋白和角蛋白。

本項目組對羅非魚皮主要化學成分進行了檢測：水分67.4%，灰分1.3%（濕基），蛋白質28.4%（濕基），脂肪1.1%（濕基），這些基本成分與葉小燕（2008）所測得的數(shù)據(jù)基本相似。

2.1 關于魚皮前處理

由于魚皮表面有色素、粘液等非膠原蛋白成分，我們選擇了NaCl作為清洗劑清洗魚皮。為了獲得最佳的清洗濃度與實踐，本項目組設計了單因素實驗，即分別以3%，5%，8%濃度的NaCl溶液清洗魚皮60hr，每12hr更換一次同濃度NaCl溶液，并抽取清洗的液體，用紫外分光光度計檢測A280處的吸光度，確定清洗程度。

圖1 不同鹽濃度清洗羅非魚皮實驗結果

由圖1可以看出，三個濃度的溶液在12hr時清洗效果差異不大，但24hr后，3%的NaCl溶液清洗時吸光度一直保持在高位，歷經(jīng)60hr魚皮仍未清洗干凈。5%和8%濃度的NaCl溶液清洗在逐步遞減，48hr和60hr的數(shù)據(jù)差異不大，肉眼觀察清洗料液較清澈，判斷在48hr時魚皮已經(jīng)清洗干凈。

考慮到成本控制及污水處理等產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需關注的問題，我們選擇5% NaCl溶液作為清洗劑，每12hr更換一次溶液，清洗48hr，作為鹽洗操作參數(shù)。

鹽洗后，為了利于膠原的浸出，我們選擇0.1mol/L NaOH溶液進行清洗魚皮，既能疏松膠原纖維之間的緊密連接又可去除魚皮中的少量脂肪。堿洗操作參數(shù)定為：0.1mol/L NaOH溶液1∶10 料液比，清洗4次，每次12 hr。

2.2 關于提取膠原

膠原蛋白是酸溶性蛋白，本項目組選用0.5mol/L的乙酸溶液作為抽提劑。這一步是制備膠原蛋白的關鍵，直接影響著膠原蛋白的得率。我們采用四個抽提料液比，即1∶30,1∶40,1∶50，1∶60，魚皮溶脹 12hr后，輕微攪拌料液，紗網(wǎng)過濾，得到第一道膠液，膠液稱重；獲得的殘渣再次分別加入乙酸溶液，第二次溶脹，12hr后過濾，得到第二道膠液，膠液稱重。經(jīng)過后續(xù)的酶解，純化，凍干后，得到膠原蛋白干品，計算得率。

圖2 不同濃度提取羅非魚皮膠原蛋白得率

不同比例的抽提液較大的影響著膠原蛋白的得率。1∶30實驗組，第一道和第二道料液濃度分別為0.33%和0.31%，相差無幾。可以認為，膠原蛋白在酸液中達到一定濃度后，就很難再浸出，只有通過提高酸液的體積來提高膠原蛋白的浸出。1∶50比例實驗組的料液濃度0.19%，雖然低于1∶30和1∶40實驗組，但是總得率卻高于這兩組。1∶60實驗組總得率與1∶50相差不多，因此，提高抽提液濃度不能無限擴大膠原的得率。

綜上所述，本項目組確定的酸溶性膠原的提取工藝參數(shù)為前處理后的魚皮經(jīng)0.5mol/L乙酸溶液抽提兩次，1∶50料液比。

酸溶性膠原提取后，為了進一步降低其抗原性，更利于生物醫(yī)用材料領域的利用，我們選擇胃蛋白酶進行端肽酶切，獲得低抗原膠原蛋白。經(jīng)實驗反復驗證，我們選定0.1%～0.2%胃蛋白酶，在4℃條件下，酶解6hr～8hr為宜。

2.3 關于膠原蛋白的純化

醫(yī)用級膠原蛋白對產(chǎn)品的純度有著極高的要求，純度高于95%以上。因此，控制雜蛋白，提高膠原純度始終貫穿于整個工藝路線中。

在酶溶性膠原酶解后，對膠原料液進行鹽析。在稀酸條件下，膠原蛋白分子在1.0～2.0mol/LNaCl時能被沉淀。我們配置飽和NaCl溶液，緩慢加入料液中，邊加邊攪拌。分別設計兩平行實驗，一份中加入4%終濃度NaCl，一份中加入5%終濃度NaCl，結果顯示，兩者所得沉淀相差無幾，可見4%濃度足夠讓膠原蛋白完全鹽析。見表1。

表1 膠原蛋白料液鹽析表

經(jīng)過初步純化的膠原蛋白，其中仍含有大量NaCl（鹽析引入）及少量蛋白多肽或小分子雜蛋白，采用透析的方法可以將其去除。

2.4 關于膠原蛋白的得率

膠原蛋白的得率與提取膠原步驟息息相關，根據(jù)實驗設計，我們將經(jīng)過純化的膠原蛋白冷凍干燥后，計算了料液比分別為1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 的酸溶性膠原蛋白 ASC、酶溶性膠原蛋白PSC的得率，結果如下表：

結果顯示：1∶50組為11.56%，1∶60組為 11.61%。得率均達到11%以上，遠高于本項目組前期做的魚鱗膠原蛋白的得率，更適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

表2 羅非魚皮膠原蛋白得率計算

3.結論

3.1 魚皮前處理

5%NaCl溶液作為清洗劑，1∶10料液比，每12hr更換一次溶液，清洗48hr；0.1mol/L NaOH溶液1∶10料液比，清洗4次，每次12hr。

3.2 提取粗膠原

0.5 mol/L乙酸溶液抽提兩次，0.1%～0.2%胃蛋白酶，在4℃條件下，酶解6hr～8hr。

3.3 膠原蛋白的純化

分級過濾，使料液與黑色素、雜質等分離；對膠原料液進行鹽析4%終濃度NaCl對膠原料液進行鹽析；透析進一步純化。

3.4 魚皮膠原蛋白的得率達到11%以上，魚鱗膠原蛋白的得率僅為5%，因此魚皮膠原蛋白的制備更適合推廣產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。