Snail蛋白在肝內膽管癌患者中的表達及其意義

朱 萌 孫武剛

1.運城護理職業學院病理學教研室，山西運城 044000；2.山西省運城市中心醫院病理科，山西運城 044000

肝內膽管癌屬于惡性腫瘤，患者的肝內膽管上皮細胞先發生病變，逐步侵襲、轉移，給患者帶來巨大的痛苦，甚至威脅患者生命[1]。相關報道顯示，近年來肝內膽管癌的發生率在世界范圍內出現增長形式，且死亡率也明顯升高[2-3]。有文獻指出，上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是引發癌細胞向局部浸潤以及轉移的重要因素之一[4-5]。Snail基因的表達產物是一種在上皮間充質轉分化過程中居于重要地位的轉錄因子。EMT是包括非小細胞肺癌在內的多種腫瘤細胞獲得侵襲轉移能力的重要機制[6-7]。本研究旨在探討Snail蛋白在肝內膽管癌患者中的表達及其意義，為臨床診治肝內膽管癌提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年3月～2016年2月在運城市中心醫院就診的72例肝內膽管癌患者，其中男37例，女35例；年齡≥65歲21例，年齡＜65歲51例；血清癌胚抗原（CEA）≥5 ng/ml 52例，＜5 ng/ml 20例； 腫瘤標志物血清 CA19-9≥37 ng/ml 39 例，CA19-9＜37 ng/ml 33例；TNM分期≤Ⅱ期42例，Ⅲ或Ⅳ期30例。所有患者均符合以下標準：①均進行相應根治性切除手術；②手術前未接受放療、化療等治療；③無心、肺等重要器官性疾?。虎芑颊呒捌浼覍倬鈪⑴c研究，并簽署知情同意書。本研究已獲得醫院醫學倫理委員會的批準。對所有患者進行隨訪，隨訪截止到2017年6月，無一例患者失訪，平均隨訪時間為（18.21±13.11）個月。

1.2 檢測方法

先制作切片，將獲得的患者組織用4%的多聚甲醛進行固定，脫去水分，石蠟包埋，組織切成薄片制片備用。將切片在90℃烘烤2 h。然后將其浸泡在二甲苯溶液中15 min，再重復進行1次。之后按順序分別放入濃度為100%、95%、90%、75%、70%的乙醇溶液中浸泡5 min。在100℃下使用濃度為10 mmol/L的檸檬酸鈉進行抗原修復，持續進行10 min后，放置室溫下30 min使其溫度降低。向切片滴加3%過氧化氫保持20 min，阻止內源性過氧化物酶發揮作用。每張切片滴加非免疫動物血清（5%牛血清蛋白），封存2 h。向切片滴加1∶500的一抗兔抗Snail單克隆抗體，進行孵育，4℃過夜。往切片滴入山羊抗兔二抗，進行孵育20 min，DAB顯色，在顯微鏡觀察下加入蘇木精進行復染，出現水化作用及透明變化，封固保存切片。使用顯微鏡進行檢查，并將觀察到的數據記錄下來。

1.3 觀察指標

①癌組織及癌旁組織Snail蛋白的表達情況：評分標準與復旦大學中山醫院肝癌研究所制定標準[8]一致，由染色面積和強度兩項組成。當染成棕色的面積超過一半時記1分，否則記0分；當未被染色時記0分，染色較淺記1分，顏色呈棕黑時記2分。兩項得分相加，分數≥2分為Snail蛋白高表達，分數＜2分則是Snail蛋白低表達。高表達率=高表達例數/總例數×100%。②臨床病理因素：包括性別、年齡、血清CEA、腫瘤標志物血清CA19-9、TNM分期、微血管是否侵犯及有無復發。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用 t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 .結果

2.1 患者癌組織及癌旁組織Snail蛋白表達情況的比較

癌組織的免疫組化評分明顯高于癌旁組織 （P＜0.05）；癌組織的Snail蛋白高表達率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）（表 1）。

表1 患者癌組織及癌旁組織Snail蛋白表達情況的比較

2.2 Snail蛋白表達與臨床病理因素的關系

不同表達的Snail蛋白之間的性別、年齡、血清CEA、腫瘤標志物血清CA19-9比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）；不同表達的Snail蛋之間的TNM分期、微血管是否侵犯及有無復發比較，差異有統計學意義（P＜0.05）（表 2）。

表2 Snail蛋白的表達與臨床病理因素的關系[n（%）]

2.3 多因素分析患者總存活率及總復發率情況

多因素分析顯示，不同TNM分期的總存活率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；微血管是否侵犯及Snail蛋白的高表達或低表達的總存活率及總復發率差異有統計學意義（P＜0.05）（表 3）。

表3 多因素分析患者總存活率及總復發率情況

3 討論

肝內膽管惡性腫瘤具有較強的侵襲能力，容易引起患者死亡，這給醫學工作者的治療工作帶來了挑戰，需要尋找準確有效的因子對肝內膽管癌的預后進行分析。EMT是惡性腫瘤發展的重要機制，其在肝內膽管癌這一惡性腫瘤的侵襲中也發揮了重要作用[9-10]。Snail蛋白是EMT發展中協助轉錄的重要蛋白因子，能夠抑制上皮細胞E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達，誘發細胞產生EMT[11-12]。本研究采用免疫組織化學方法，對肝內膽管癌患者癌組織及癌旁組織標本中Snail蛋白的表達情況進行了檢測，旨在尋找肝內膽管癌患者預后評價的有效標志物。

本研究結果顯示，癌組織的免疫組化評分明顯高于癌旁組織（P＜0.05）；癌組織的Snail蛋白高表達率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）?？赡茉蚴窃谀[瘤組織中，Snail蛋白的表達更多，進一步提示Snail蛋白的表達與癌組織的轉移等有關[13-14]。Snail蛋白的表達與性別、年齡、癌胚抗原血清CEA、腫瘤標志物血清CA19-9 之間無明顯差異（P＞0.05）；Snail蛋白的表達與TNM分期、微血管是否侵犯及有無復發，存在明顯差異（P＜0.05），提示Snail蛋白的表達與肝內膽管癌的侵襲、轉移、復發有關，這與周博鑫等[15-16]的研究結果一致。其可能通過作用于肝內膽管上皮細胞，使細胞表型等方面發生改變，促使其發生EMT，進而導致肝內膽管癌進一步侵襲[17-18]，這也提示可以從轉錄因子Snail蛋白方面入手，尋找減弱癌細胞轉移能力的方法，抑制腫瘤細胞的侵襲，從而減輕患者痛苦，為患者帶來希望[19]。

本研究結果還顯示，TNM分期對總存活率的差異無統計學意義（P＞0.05）；微血管是否侵犯及Snail蛋白的高表達或低表達的總存活率及總復發率差異有統計學意義（P＜0.05）。對肝內膽管癌患者進行免疫組織化學檢測，能夠為臨床工作提供有效的依據，且對于減少患者術后復發情況的發生及提高患者存活率有著重要的意義[20]。

綜上所述，免疫組織化學檢測肝內膽管癌患者癌組織中Snail蛋白的表達要高于癌旁組織，并且Snail蛋白的表達與肝內膽管癌的侵襲、轉移、復發有關，可以作為評價肝內膽管癌患者預后的指標。