遵義地區(qū)4 055例珠蛋白生成障礙性貧血基因分型結(jié)果分析

李 彥，陳秋月，晏亞萍，肖代敏

(遵義醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563003)

珠蛋白生成障礙性貧血(簡(jiǎn)稱地貧)是一種由遺傳性珠蛋白基因缺陷(缺失或突變等)導(dǎo)致的慢性溶血性貧血。根據(jù)珠蛋白4種肽鏈合成障礙的不同，可將地貧分為α、β、γ和δ 4種類型，其中以α-地貧和β-地貧最為常見(jiàn)[1]。該病廣泛分布于世界各地，主要集中在地中海沿岸地區(qū)及東南亞地區(qū)，在我國(guó)以廣東、廣西、海南、貴州、四川發(fā)病率高。迄今為止，臨床對(duì)地貧患者的治療主要是以對(duì)癥治療為主，對(duì)地貧的根治仍缺乏切實(shí)有效的方法。因此，把好三關(guān)(婚檢、孕檢和產(chǎn)檢)對(duì)預(yù)防地貧患兒的出生是最為重要的手段和方法。遵義地處于重慶與貴陽(yáng)之間，常住人口近1 000萬(wàn)，目前較少見(jiàn)本地區(qū)人群地貧基因缺陷的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究采用熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)溶解曲線法對(duì)本地區(qū)人群，尤其是孕期女性及疑似地貧患者進(jìn)行地貧基因檢測(cè)，旨在探討遵義地區(qū)地貧的發(fā)生率及基因型分布情況，為遺傳篩查和產(chǎn)前診斷提供科學(xué)依據(jù)，以期達(dá)到預(yù)防和控制地貧患兒出生和實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育的目的。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年6月至2018年3月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行地貧基因檢測(cè)的遵義地區(qū)常住人員共計(jì)4 055例，其中孕檢及體檢篩查人員3 391例，血液內(nèi)科疑似地貧患者[平均紅細(xì)胞體積(MCV)<80 fL和 (或)平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)<26 pg]664例，男女不限，年齡0～60歲。

1.2儀器與試劑 Lab-aid824全自動(dòng)核酸提取儀及配套的磁珠法核酸提取試劑盒(廈門致善生物科技有限公司)， SLAN-96P Real-Time PCR-儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)，缺失型α-地貧、非缺失型α-地貧和β-地貧基因檢測(cè)試劑盒(廈門致善生物科技有限公司)，XE-5000的全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀及配套試劑(日本Sysmex有限公司)。

1.3方法

1.3.1血常規(guī)篩查 采集靜脈血3 mL，用全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀檢測(cè)MCV和MCH，以MCV<80 fL和(或)MCH<26 pg為標(biāo)準(zhǔn)判為疑似患者。

1.3.2DNA提取 抽取檢測(cè)者外周血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，嚴(yán)格按操作說(shuō)明書(shū)，通過(guò)磁珠法應(yīng)用全自動(dòng)核酸提取儀提取人類基因組DNA，備用。

1.3.3地貧基因檢測(cè) 采用熒光PCR溶解曲線法，通過(guò)熒光探針與PCR產(chǎn)物雜交后熔點(diǎn)的變化檢測(cè)基因是否突變或缺失。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別配制β、缺失型α、非缺失型α的反應(yīng)液于PCR薄壁反應(yīng)管中，并按順序加入5 μL提取的DNA樣品、陰性及野生型對(duì)照，短暫離心后，放置于SLAN-96P 實(shí)時(shí)熒光PCR儀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及溶解曲線分析。擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s、76 ℃ 45 s，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、76 ℃ 45 s，50個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析程序：95 ℃ 1 min；35 ℃ 3 min；40～85 ℃，設(shè)置在此階段每0.4 ℃采集FAM、HEX、ROX和Cy5通道熒光信號(hào)。

1.4結(jié)果判斷 比較待測(cè)標(biāo)本在4個(gè)不同檢測(cè)通道與野生型對(duì)照之間熔解峰(Tm值)的差異來(lái)綜合判斷標(biāo)本的基因型，具體檢測(cè)結(jié)果參照說(shuō)明書(shū)和通過(guò)儀器自動(dòng)判讀進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同就診對(duì)象地貧基因陽(yáng)性檢出率 4 055例受檢者中，3 391例為孕檢、體檢篩查者，664例為血液內(nèi)科送檢疑似患者，孕檢、體檢篩查者中檢測(cè)出地貧基因陽(yáng)性399例，陽(yáng)性率為11.77%，其中雙重復(fù)合為19例；疑似患者中檢測(cè)出地貧基因陽(yáng)性388例，陽(yáng)性率為58.43%，其中雙重復(fù)合為26例。疑似患者地貧基因陽(yáng)性率明顯高于孕檢、體檢篩查者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2地貧基因缺陷類型分布 4 055例受檢者中，檢測(cè)出α-地貧408例，占49.04%，β-地貧424例，占50.96%，共包含17種基因型，其中α-地貧以α缺失型αα/-α3.7最多，含雙重復(fù)合型雜合子在內(nèi)共184次，占22.12%，其次是α缺失型--SEA/αα，含雙重復(fù)合在內(nèi)共166次，占19.96%；β-地貧以CD17最多，含雙重復(fù)合在內(nèi)共178次，占21.40%，其次是CD41-42，含雙重復(fù)合在內(nèi)共107次，占12.86%；在試劑盒范圍內(nèi)未檢測(cè)出的基因型別有CD14-15、CD15-16、-30、-31、-32、CD31、IVS-Ⅰ-1、CD30、IVS-Ⅱ-5、-73、-90。見(jiàn)表1。

表1 地貧基因型別構(gòu)成比

2.3地貧基因雙重復(fù)合型分布 4 055例受檢者中共檢測(cè)出雙重復(fù)合45例，檢出率為1.11%，其中以α-地貧復(fù)合α-地貧為主，共33例，占73.34%，主要以--SEA/-α3.7為主，共21例，占46.67%；α-地貧復(fù)合β-地貧共12例，占26.66%；未檢測(cè)出β-地貧復(fù)合β-地貧。

表2 地貧基因復(fù)合型別構(gòu)成比

3 討 論

地貧是我國(guó)南方常見(jiàn)的單基因遺傳疾病，嚴(yán)重危害著人類健康，雙方為地貧基因攜帶者的夫妻下一代有四分之一的概率患重型地貧[2]，且目前對(duì)重型地貧尚無(wú)有效的治療方法，僅通過(guò)長(zhǎng)期輸血維持生命，而長(zhǎng)期反復(fù)輸血會(huì)導(dǎo)致患兒體內(nèi)鐵負(fù)荷過(guò)重，最終導(dǎo)致心、肝等重要器官損傷、衰竭。因此，對(duì)育齡夫婦進(jìn)行地貧基因篩查，對(duì)地貧基因攜帶夫婦妊娠后進(jìn)行產(chǎn)前地貧基因診斷，是降低重型地貧患兒出生率的唯一有效途徑[3]，也是國(guó)際上公認(rèn)的地貧預(yù)防對(duì)策[4]。

地貧發(fā)病具有地域性，不同地區(qū)發(fā)病率不同。我國(guó)長(zhǎng)江以南發(fā)病率較高。主要以海南、廣西、廣東、貴州、重慶等地區(qū)攜帶率較高，調(diào)查顯示，海南地區(qū)地貧攜帶率高達(dá)50%[5]，廣西地區(qū)達(dá)到20%[6]，廣東、貴州、重慶等地區(qū)也有10%左右的攜帶率[7-10]。本研究結(jié)果顯示3 391例孕檢、體檢篩查者地貧基因檢測(cè)陽(yáng)性率為11.77%，略高于貴州地區(qū)地貧基因攜帶率，說(shuō)明遵義屬于貴州地區(qū)地貧高發(fā)地區(qū)，因此更應(yīng)重視婚前及孕前的地貧基因篩查及產(chǎn)前診斷工作。而664例疑似患者的地貧基因檢測(cè)陽(yáng)性率為58.43%，明顯高于孕檢、體檢篩查者的陽(yáng)性率，與何麗等[11]報(bào)道的重慶地區(qū)MCV、MCH低于健康者人群地貧基因檢測(cè)陽(yáng)性率較高結(jié)果類似，說(shuō)明MCV、MCH的檢測(cè)在地貧初篩中有重大的臨床意義。

本研究中4 055例受檢者共檢測(cè)出α-地貧408例，占49.04%，β-地貧424例，占50.96%，α-地貧和β-地貧的發(fā)生率均衡，沒(méi)有偏向性。相關(guān)調(diào)查報(bào)道顯示貴州、重慶地區(qū)以β-地貧為主，廣東、廣西、海南等地區(qū)以α-地貧為主[5-10]，本研究結(jié)果與之均不相符。說(shuō)明遵義地區(qū)地貧基因型有其自身獨(dú)有的特點(diǎn)，在篩查中應(yīng)對(duì)α-地貧和β-地貧同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以免發(fā)生漏診。此次研究共檢測(cè)出17種基因型，其中α-地貧以α缺失型αα/-α3.7最多，占22.12%，其次是α缺失型--SEA/αα，占19.96%，與莫亞虹等[12]報(bào)道的海南地區(qū)最常見(jiàn)的α-地貧基因型是αα/-α3.7一致，但與其他地區(qū)報(bào)道α-地貧以α缺失型--SEA/αα為主不同[5-10]；β-地貧以CD17為最多，占21.40%，其次是CD41-42和IVS-Ⅱ-654，分別占12.86%和10.46%，與貴陽(yáng)、重慶β-地貧基因型別發(fā)生率排序相同[13],但與國(guó)內(nèi)廣東、廣西、海南地區(qū)所報(bào)道的β-地貧基因型別以CD41-42為主，其次是IVS-Ⅱ-654和CD17的排序不一致[14-15]。說(shuō)明不同區(qū)域，地貧基因型別也不同，但也許相鄰地區(qū)型別分布較為類似。

綜上所述，遵義是地貧高發(fā)地區(qū)，必須加強(qiáng)地貧知識(shí)的宣傳、普及，從預(yù)防、治療和信息管理等方面入手，控制地貧基因的蔓延，做好地貧基因篩查工作，對(duì)血常規(guī)異常者應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)地貧基因，降低地貧漏診率，通過(guò)產(chǎn)前篩查，降低地貧患兒出生率，提高人口素質(zhì)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。