正交實驗法優化明黨參中氯化膽堿的提取工藝

杜 清，秦民堅*，吳 剛

（1.青海民族大學藥學院，青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室，青海 西寧 810007；2.中國藥科大學中藥資源學研究室，江蘇 南京 210038；3.青海省藥物分析重點實驗室，青海 西寧 810007）

明黨參（Radix Changii）為傘形科明黨參屬單種植物明黨參（Changium smyrnioides Wolff）的干燥根[1]，是國家二級瀕危保護植物[2]，主產于江蘇、安徽、浙江等地[3]，陳建偉等[4]從明黨參中首次分得膽堿。氯化膽堿（choline chloride）與正常脂肪代謝和運轉有關，是一種抗脂肪肝因子的有效成分，用于肝炎、早期肝硬化、脂肪肝等的輔助治療劑[5]，氯化膽堿60%水劑、50%可濕性粉劑可用作蛋雞生產等的飼料添加劑[6]，氯化膽堿有諸多的功效和實際作用，故借鑒GB/T17481-1998中的方法并應用正交實驗法篩選和優化膽堿類功效成分[7，8]，為今后更好地應用明黨參藥材中的膽堿成分提供切實可行的依據。現報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

明黨參藥材采購于安徽亳州藥材市場，經中國藥科大學秦民堅教授鑒定為傘形科明黨參Changium smyrnioides Wolff.的干燥根，粉碎過篩60目備用。

1.2 試劑和儀器

氯化膽堿標準品購于中國藥品生物制品鑒定所：雷氏鹽：Sigma Aldrich of D-89552/Fluka chemie；硝酸（南京化學試劑一廠），甲醇（江蘇漢邦科技有限公司）；正丙醇（上海凌峰化學試劑有限公司），氫氧化鈉（上海凌峰化學試劑有限公司）；丙酮（天津市博迪化工有限公司），水浴鍋（國華電器有限公司），循環水式真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；RE-52A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；UV-2501可見分光光度計（日本島津公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 5%雷氏銨鹽甲醇溶液的配制

將雷氏鹽5 g溶解在100 mL甲醇中超聲即得，放于冰箱中保存。

1.3.2 氯化膽堿標準液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的氯化膽堿標準品200 mg，置于200 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（即濃度為1 mg/mL）。

1.3.3 比色及最大吸收波長的確定

取氯化膽堿對照品溶液加入適量5%雷氏銨鹽甲醇溶液，靜置析晶，濾取結晶，丙酮溶解，UV-2501分光光度計作全波長掃描，確定最大吸收峰及波長。

1.3.4 標準曲線的制作

分別取氯化膽堿標準液2，4，6，8，10，12，14，16，18 mL，分別加水至20 mL，再加入5%雷氏銨鹽甲醇夜各5 mL，冰箱放置生成膽堿雷氏鹽結晶。濾取結晶，用正丙醇洗三次，丙酮溶出，定容至25 mL，在520 nm波長處測定吸光度，以含量（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 樣品溶液中膽堿的測定

稱取60℃干燥的小樣10 g，硝酸加熱回流分解提取，濾液用40%的氫氧化鈉調節PH至9～10，加入過量甲醇，冰箱放置1夜，濾液濃縮加入雷氏銨鹽甲醇溶液，生成粉紅色片狀結晶，用正丙醇清洗，丙酮溶解結晶后定容至25ml容量瓶中，吸取5 mL用丙酮定容至25 mL容量瓶，在520 nm處測定吸光度，由氯化膽堿標準曲線方程計算氯化膽堿的濃度C，并計算樣品中膽堿的百分含量：膽堿含量（mg/100 g）=C*0.746*稀釋倍數/稱樣量*100；

式中：0.746為膽堿系數。

1.4 提取工藝的初步設想

將工藝提取條件考慮設計如下：

（1）提取時所用酸水的濃度：常用0.1～1.0%的酸水液提取，因此選擇0.1%，0.5%，1.0%的硝酸溶液；（2）提取時間：文獻中會用7小時，故選擇3小時，5小時和7小時；（3）提取所用酸水的體積：5倍，10倍和20倍；（4）提取次數：1次，2次和3次。

1.5 提取工藝的正交設計

對2.6中的條件采用四因素三水平的正交表L9（34），見表1，考察使用紫外分光光度法測得氯化膽堿的含量來篩選最佳條件。

表1 正交實驗因素水平表

2 結 果

2.1 標準曲線及線性范圍

以濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制的標準曲線如圖1所示，回歸方程式為：A=0.0098+1.2393C，r=0.9986，說明氯化膽堿標準品溶液在0.08～0.72 mg/mL與其吸光度成線性相關。

2.2 提取工藝正交實驗的結果

按照2.7的正交實驗設計方法測定明黨參藥材中氯化膽堿的含量，結果詳見表2。

圖1 氯化膽堿標準品溶液的標準曲線圖譜

表2 明黨參藥材中氯化膽堿的提取工藝正交實驗結果表（n，%）

2.3 提取工藝正交實驗結果的方差分析

根據3.2的正交實驗結果，進行方差分析，結果見表3。

表3 明黨參中氯化膽堿含量的方差分析

表3選擇方差最小的B作為空白對照，從方差分析結果可看出各個因素對明黨參中氯化膽堿的提取工藝影響的大小分別為A＞C＞D＞B而且最優化的方案為A2B2C3D1。

2.4 提取工藝正交實驗的直觀分析圖

2.4.1 酸濃度對明黨參中膽堿提取的影響

根據提取工藝結果，從圖2中可看出，酸濃度最合適為0.5%時提取出的明黨參膽堿得率最高。

2.4.2 提取時間對明黨參中膽堿提取的影響

根據提取工藝結果，從圖3中可看出，提取時間最合適為2小時，提取出的明黨參膽堿得率最高。

圖2 酸濃度對明黨參中膽堿提取的影響

圖3 提取時間

2.4.3 所用酸濃度對對明黨參中膽堿提取的影響

根據提取工藝結果，從圖4中可看出，所用酸體積20倍時，提取出的明黨參膽堿得率最高。

圖4 提取出的明黨參膽堿所用酸體積

2.4.4 提取次數對明黨參中膽堿提取的影響

根據提取工藝結果，從圖5中可看出，提取1次提取出的明黨參膽堿得率最高。

圖5 提取次數對明黨參中膽堿提取的影響

2.4.5 明黨參中氯化膽堿提取的優化工藝條件

根據明黨參中氯化膽堿提取的正交實驗結果和方差分析，可得其最優化工藝條件為：明黨參粉末于60℃干燥粉碎后用0.5%，20倍的硝酸溶液加熱回流分解提取1次，每次5小時，濾液用40%NaOH溶液調節PH至9～10，加入過量甲醇，冰箱放置過夜，抽濾后得濾液，濃縮加入雷氏銨鹽甲醇溶液，生成粉紅色片狀結晶，將此結晶溶解后定容，紫外分光光度測定即可得到氯化膽堿的含量。

2.5 明黨參中氯化膽堿提取優化工藝條件的驗證試驗

按照3.5的優化工藝條件提取三批明黨參藥材樣品并測定其中氯化膽堿的含量，見表4。

表4 明黨參中氯化膽堿提取工藝的驗證試驗

由表4中的工藝驗證實驗結果可得明黨參藥材中氯化膽堿的平均得率為（37.02±2.8）%，RSD偏差＜3.0%，說明該工藝穩定可行。

3 討 論

對明黨參中膽堿的提取工藝進行摸索，從實驗結果可得出A2B2C3D1為最合適的提取分離條件；從四個因素水平（酸水液的濃度、提取時間、提取所用酸水的體積、提取次數）的直觀分析圖也佐證了明黨參的最佳提取工藝條件如3.5中所總結出的結論，由優化后的工藝進行樣品驗證，相對標準偏差較小，說明該工藝穩定可行，可適用于明黨參中氯化膽堿的提取分離。