熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

王岱杰，于金倩，崔莉，付瑞明，宋祥云，耿巖玲

（山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014）

熊果酸（ursolic acid），又名烏索酸，是廣泛存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類(lèi)化合物（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），現(xiàn)代藥理研究表明，熊果酸具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒、保肝、抗抑郁、降低大腦氧化損傷、治療糖尿病和殺蟲(chóng)等多種特性[1-15]，同時(shí)對(duì)肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多種癌癥細(xì)胞模型具有良好的抑制效果[16-23]。熊果酸是《藥典》規(guī)定的山楂、木瓜、烏梅、山茱萸和大葉紫珠等12味藥材及相關(guān)復(fù)方的鑒別和質(zhì)量控制指標(biāo)[24]，同時(shí)山楂、木瓜、烏梅和山茱萸都是藥食同源或可用于保健食品的植物，目前市場(chǎng)上熊果酸樣品主要以對(duì)照品為主，純度參差不齊，未按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性和定值試驗(yàn)，最終結(jié)果沒(méi)有不確定度評(píng)價(jià)，樣品也不具有溯源性，制約了各類(lèi)以山楂、木瓜、烏梅和山茱萸等為原料的中藥、食品、保健品等產(chǎn)品的質(zhì)量控制，因而亟需標(biāo)準(zhǔn)化的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。

標(biāo)準(zhǔn)樣品是具有一種或多種足夠均勻的和很好確定了特性值的材料或物質(zhì)，可以用來(lái)校準(zhǔn)儀器、評(píng)價(jià)測(cè)量方法和給材料賦值[25]。隨著天然產(chǎn)物包括中藥材市場(chǎng)國(guó)際化的發(fā)展，研制與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）對(duì)接的標(biāo)準(zhǔn)樣品的需求愈發(fā)迫切，也是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，我國(guó)研發(fā)的天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品種類(lèi)和數(shù)量嚴(yán)重不足，影響相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)，也制約了相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。為改善這一現(xiàn)狀，我國(guó)天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究正在廣泛開(kāi)展[26]。因此，為了滿(mǎn)足熊果酸及相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)需求，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，本文參照ISO導(dǎo)則35和GB/T 15000.3-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[27]，以薔薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥成熟果實(shí)為原料，成功研制了熊果酸國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品。

圖1 熊果酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of ursolic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NKA型大孔樹(shù)脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；柱層析硅膠、GF254薄層硅膠板：青島海洋化工廠(chǎng)；高效液相色譜用甲醇（色譜純）：美國(guó)天地公司；水為重蒸水；其它試劑為分析純；山楂藥材：濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為薔薇科植物山楂的干燥成熟果實(shí)，樣本存放于山東省分析測(cè)試中心。

1.2 儀器與設(shè)備

R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；E2695型高效液相色譜儀：美國(guó)waters公司；ZF-I型三用紫外分析儀：上海顧村電光儀器廠(chǎng)；TH-II型薄層加熱器：上海科哲生化科技有限公司；WRS-1B型數(shù)字熔點(diǎn)儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；INOVA 600 MHz核磁共振波譜儀：美國(guó)瓦里安公司；6520 Q-ToF型液質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；STA 449FC型同步熱分析儀：德國(guó)耐馳公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取山楂藥材5 kg粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，等體積石油醚脫脂3次，水溶液進(jìn)行NKA大孔樹(shù)脂富集，分別用純水、25%乙醇、50%乙醇、85%乙醇、95%乙醇洗脫，85%乙醇洗脫部分濃縮，冷凍干燥，得熊果酸粗品。將熊果酸粗品經(jīng)硅膠柱色譜反復(fù)分離，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫，收集含熊果酸組分。薄層色譜跟蹤監(jiān)測(cè)，石油醚∶乙酸乙酯（4∶1，體積比）為展開(kāi)劑。將收集到的相同部分放置在通風(fēng)櫥內(nèi)，乙醇重結(jié)晶，過(guò)濾并干燥。

1.3.2 純度分析方法

1.3.2.1 高效液相色譜分析

等度條件：shim-pack C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2%乙酸水溶液（91∶9，體積比）；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：35 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；樣品濃度0.2mg/mL，甲醇溶解。梯度條件：YMC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為 0.2%乙酸水溶液；0～25 min，91%A，25 min～45 min，91%A～100%A，45 min～55 min，100%A。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：55 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，樣品同上。

1.3.2.2 薄層鑒別

精密稱(chēng)取樣品5mg，加甲醇配制成濃度為0.2 mg/mL對(duì)照品溶液。展開(kāi)劑分別為氯仿-甲醇（100∶1，體積比）和石油醚-乙酸乙酯（4∶1，體積比），定量毛細(xì)點(diǎn)樣管吸取 20、40、60、80、100 μg，梯度將樣品點(diǎn)于 GF254硅膠板。兩種展開(kāi)劑分別展開(kāi)，取出，晾干，分別用10%硫酸乙醇法顯色，105℃下加熱3 min，至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）純度分析

分析條件：shim-pack C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇/0.2%乙酸水溶液（91∶9，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：30 min。MS條件：ESI電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，載氣為載氣，載氣流速為10 L/min，載氣溫度為300℃，掃描范圍 m/z 100～1 000。

1.3.2.4 熱重分析

精密稱(chēng)取樣品5 mg，置于熱重用坩堝中，熱重條件：初溫30℃，最終溫度600℃，升溫速率10℃/min，氣體 N2，流量 100 mL/min。

1.3.3 結(jié)構(gòu)表征

熊果酸單體的結(jié)構(gòu)表征采用紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)。紫外光譜法的測(cè)試溶劑為甲醇，掃描范圍為200 nm～400 nm；紅外光譜法采用KBr壓片，掃描波數(shù)為 400 cm-1～4 000 cm-1；質(zhì)譜為電噴霧離子源，載氣溫度為300℃，載氣流速為10 L/min，載氣為載氣，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，掃描范圍m/z為100～1 000；核磁共振法的氘代試劑為DMSO-d6。

1.3.4 均勻性檢驗(yàn)

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品導(dǎo)則（均勻性研究）要求[27]，采用順序重復(fù)隨機(jī)測(cè)量，隨機(jī)抽取分裝好的熊果酸樣品10瓶，3種抽樣程序（第1種1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第 2種 10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第 3 種 2-4-6-8-10-1-3-5-7-9），樣品按1.3.2中規(guī)定純度方法進(jìn)行分析，樣品純度讀取采用峰面積歸一化法，采用方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

熊果酸樣品儲(chǔ)存溫度為0℃～4℃，考察樣品的2年穩(wěn)定期，分5個(gè)時(shí)間段考察監(jiān)測(cè)，按1.3.2中規(guī)定純度方法進(jìn)行分析，樣品純度讀取采用峰面積歸一化法，每份樣品測(cè)定5次，統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)法[28]。

1.3.6 定值

根據(jù)工作導(dǎo)則，標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值采用8家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作進(jìn)行的方法。隨機(jī)抽取樣品24瓶，每家定值實(shí)驗(yàn)室寄出樣品3瓶，每瓶測(cè)定2次，協(xié)作實(shí)驗(yàn)室共出6個(gè)檢測(cè)結(jié)果，樣品純度以峰面積歸一化法讀取[27-28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度分析

采用HPLC的二極管陣列檢測(cè)器對(duì)色譜峰進(jìn)行3D總吸收?qǐng)D掃描，檢測(cè)結(jié)果扣除溶劑峰，HPLC純度分析結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和圖4。

圖2 熊果酸等度洗脫HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of ursolic acid by socratic elution

圖3 熊果酸梯度洗脫HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram by gradient elution

圖4 熊果酸HPLC 3D掃描圖Fig.4 Three dimensional chromatogram of ursolic acid by HPLC

由圖2～圖4可知，未見(jiàn)明顯雜質(zhì)峰存在，樣品純度良好。以氯仿-甲醇（100∶1，體積比）和石油醚-乙酸乙酯（4∶1，體積比）為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)，10%硫酸乙醇顯色。薄層結(jié)果表明，樣品呈現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn)，Rf值分別為0.51和0.49，未見(jiàn)明顯雜質(zhì)斑點(diǎn)存在。

HPLC-MS的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 熊果酸樣品的液質(zhì)譜總離子流圖Fig.5 Total ionic chromatogram of ursolic acid by HPLC-MS

由圖5可知，未見(jiàn)明顯的雜質(zhì)峰存在。

熱重分析的結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 熊果酸的熱重圖Fig.6 The thermogravimetric curve of ursolic acid

由圖6可知，在25℃～189℃溫度范圍內(nèi)，熱重分析曲線(xiàn)是一條水平線(xiàn)，表明測(cè)試樣品中吸附水和結(jié)晶水含量很低，熱穩(wěn)定性好。當(dāng)溫度增加超過(guò)189℃時(shí)，樣品開(kāi)始分解，差熱分析法（differential thermal analysis，DTA）曲線(xiàn)顯示溫度升高到261.5℃，樣品迅速分解。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.3 均勻性檢驗(yàn)

將結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，確定熊果酸樣品的均勻性，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 Results of homogeneity test %

表2 方差分析數(shù)據(jù)Table 2 Results of variance analysis

瓶間方差的計(jì)算公式：

則瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

F值的計(jì)算公式：

以組間自由度υ1=9及組內(nèi)自由度υ2=20為變量查詢(xún)F界值表，可知臨界值F0.05（9，20）=2.94，由于F＜F0.05（9，20），因此所研制的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品具有良好的均勻性。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

采用t檢驗(yàn)法對(duì)穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，采用直線(xiàn)模型，觀察直線(xiàn)斜率值變化趨勢(shì)，同時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Result of stability test %

斜率計(jì)算公式如下：

式中：y=99.79；x=12。

截距計(jì)算公式如下：

直線(xiàn)模型的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

則s=0.03

斜率相關(guān)不確定度計(jì)算公式如下：

查表得自由度為n-2和95%置信水平（p=0.95）分布的t因子為3.182。

由于斜率變化的絕對(duì)值|b1|＜t0.95，n-2·s（b1）=3.182×0.002=0.009 5，

即：|b1|＜0.009 5。

因此，斜率變化不顯著，即熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在兩年內(nèi)穩(wěn)定性良好。

穩(wěn)定性的不確定度為：

u穩(wěn)=Sb×t=0.003×24=0.08

2.5 定值

根據(jù)各個(gè)協(xié)作實(shí)驗(yàn)室的反饋結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，并最終確定熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4。

表4 協(xié)作定值數(shù)據(jù)Table 4 Results of purity value results %

測(cè)定結(jié)果總平均值的計(jì)算公式如下：

實(shí)驗(yàn)室平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

總平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

多家定值引入的不確定度

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度由如下3部分組分：（1）均勻性檢驗(yàn)不確定度；（2）穩(wěn)定性檢驗(yàn)不確定度；（3）定值不確定度，這3部分不確定度分量互不相關(guān)，需將3種不確定度合成，即合成不確定度（U合成）為：

代入數(shù)據(jù)計(jì)算得U合成=0.09%

置信區(qū)間95%時(shí)，k=2

則熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)展不確定度：

3 結(jié)論

本研究針對(duì)熊果酸及相關(guān)產(chǎn)品缺乏國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的現(xiàn)狀，嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)規(guī)定的標(biāo)樣樣品研制規(guī)則，成功的研制出熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，并順利通過(guò)了專(zhuān)家驗(yàn)收。研制過(guò)程中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性進(jìn)行考察，并進(jìn)行方差分析；穩(wěn)定性檢驗(yàn)采用直線(xiàn)模型，并進(jìn)行了t檢驗(yàn)法考察；定值采用多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作，對(duì)定值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)3個(gè)方面引入的不確定度，進(jìn)行了不確定度的合成和擴(kuò)展，獲得了標(biāo)準(zhǔn)值為99.80%，置信度95%的不確定度為0.18%的熊果酸國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，具有樣品溯源性，可用于相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)方法評(píng)定和含量測(cè)定，填補(bǔ)了熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的國(guó)內(nèi)外空白。