谷物中多種真菌毒素的UPLC-Q-Trap MS高通量篩查和定量方法的研究

（廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧530021）

真菌毒素（mycotoxin）是一類產自絲狀真菌的有毒次生代謝產物[1]，常見的真菌毒素有黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）、赭曲霉毒素（ochratoxin，OT）、伏馬菌素（fumonisin，FB）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等，在適宜的環境下，能侵襲、污染各種農作物，嚴重影響農作物的產量，降低農產品以及飼料的營養和經濟價值，造成巨大的經濟損失[2]。研究表明，真菌毒素具有DNA毒性和細胞毒性，會致癌、致畸和致突變，且抑制家畜的免疫及生長。若人畜以較高的等級暴露在這些毒素污染物中，最終誘發種種生理危害，即所謂的霉菌毒素綜合征（mycotoxicoses）[3-6]。因此，真菌毒素的監控問題迫在眉睫。

真菌毒素的主要分析方法有薄層色譜法（thinlayer chromatography，TLC）[7]、酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）[8-9]、液相色譜法（liquid chromatography，LC）[10-11]、液相色譜串聯質譜法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS/MS）[12-13]、氣相色譜串聯質譜法（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS/MS）[14]。液相色譜是最常用的檢測方法，但其靈敏度低，并且干擾大，無法滿足多毒素同時檢測；薄層色譜法簡單、便利，但精密度與重現性欠缺；免疫化學檢測法特異性強，但假陽性率過高；氣質串聯質譜法雖然滿足了精密度、靈敏度的要求，但前處理需要衍生，耗時太長，無法滿足大批量檢測的需求；液相色譜串聯質譜法兼具了前處理無需衍生，操作簡便，準確性強，靈敏度高，精密度好，能滿足多樣品多通量的檢測要求的特點，已經越來越受到真菌毒素檢測領域的青睞。高效液相色譜串聯線性離子阱質譜（high performance liquid chromatography-linear ion trap mass spectrometer，UPLC-Q-trap MS）兼具液相色譜串聯質譜法的優點，以信息依賴性掃描（information de pendent acquisition，IDA）的邏輯選項（criteria）整合探測掃描（survey scan）和觸發掃描（dependent scan），實現在一次采樣中同時獲得兩種或兩種以上不同采樣模式的數據，定量的同時可以兼顧定性，降低假陽性率。

QuEChERS于2003年提出，是一種均質后的樣品經乙腈（或酸化乙腈）提取，采用萃取鹽包鹽析分層后，利用分散固相萃取機理，采用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附劑或其它吸附劑與基質中絕大部分干擾物（有機酸、脂肪酸、碳水化合物等）結合，通過離心方式去除，從而達到凈化樣品溶液的一種樣品前處理方法[15]，具有快速（Quick）、簡便（Easy）、節約（Cheap）、高 效（Effective）、耐 用（Rugged）、安 全（Safe）的特點[16-18]。本研究采用基于QuEChERS改造的提取方法（DisQuE QuEChERS），用含10%甲酸的乙腈溶液進行樣品的提取，提取液經QuEChERS提取鹽包進行鹽析分層，上清液經過SPE小柱、分散固相萃取凈化管凈化，高效液相色譜-線性離子阱法（UPLC-Q-trap MS）進行真菌毒素的定性、定量檢測，該方法操作簡便，安全，準確性高，重復性好，有助于假陽性樣品的排除，為食藥安全提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DGU-20A5R高效液相色譜儀：日本島津公司；Qtrap 4500三重四級桿質譜：美國AB SCIEX公司；離心機（型號ROTANTA460/460R）：德國Hettich科學儀器公司；震蕩儀（型號KS260）：德國IKA儀器設備有限公司；氮吹儀（型號 Multivap）：美國Organomation公司；Milli-Q超純水機（型號A10）：美國Milli-pore公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）：美國Waters公司。

乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：德國默克公司；QuEChERS 提取鹽包 （0.5 g Na Sesquihydrate，1.5 g NaCitrate/1 g NaCl/4 g MgSO4）、Oasis PRiME HLB 小柱（3 cc，150 mg）、凈化管（2 mL，150 mg MgSO4/50 mg PSA/30 mg C18/30 mg Al N）：美國 Waters公司。

標準品溶液：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Biopure公司，100 μg/mL，deoxynivalenol，DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 [Romer公司，（101.0±1.4）μg/mL，3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON]、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[Romer公司，（100.5±0.6）μg/mL，15-acetyldeoxynivalenol，15-ADON]、伏馬毒素B（1Romer公司，50.0 μg/mL，fumonisinB1，FB）1、伏馬毒素B（2Romer公司，50.2 μg/mL，fumonisinB2，FB）2、伏馬毒素B（3Romer公司，50.1 μg/mL，fumonisin B3，FB3）、黃曲霉 毒 素 B1（Pribolab 公司，10 μg/mL，aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B（2Pribolab公司，10 μg/mL，aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素 G1（Pribolab 公司，10 μg/mL，aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素 G2（Pribolab 公司，10 μg/mL，aflatoxin G2，AFG2）、玉米赤霉烯酮（Biopure公司，100 μg/mL，zearalenone，ZEA）、赭曲霉毒素 A（SUPELCO 公司，50 μL/mL，ochratoxin，OTA）。

大米、小麥、玉米：均來自南寧市某超市和廣西區抽樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的前處理

QuEChERS提取：稱取2 g樣品，裝入50 mL離心管中。加入10 mL水和10 mL含10%甲酸的乙腈溶液，將樣品置于自動振蕩器中振搖1 h。然后加入QuEChERS提取鹽包，劇烈振搖1 min，于4 500 r/min下離心5 min，上清液備用。

凈化：吸取0.4 mL上清液過Oasis PRiME HLB小柱，棄去濾液，再吸取1 mL上清液于小柱并收集濾液。將收集到的濾液轉移到凈化管中，于4 500 r/min下離心1 min，取500 μL上清液，氮吹至近干，用15%乙腈溶液 250 μL 溶解，超聲 30 s，渦旋混勻，過 0.22 μm 濾膜，即得。

1.2.2 標準曲線溶液的配制

精密吸取各標準品溶液適量，分別用甲醇配制成濃度約為200 ng/mL的標準溶液，供優化各化合物質譜參數使用。

基質匹配混合標準曲線溶液的配制：取空白大米、小麥、玉米樣品，按“1.2.1樣品的前處理”方法制備，上清液轉移至氮吹管中，分別加入各真菌毒素標準溶液適量，氮氣吹干后，加入15%乙腈溶液復溶，超聲30 s，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，即得，混合標準曲線溶液濃度見表1。

表1 標準曲線溶液中各真菌毒素的濃度Table 1 The concentration for 12 kinds of mycotoxins

1.2.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為含0.1%甲酸水溶液，B為含0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1 min～5 min，5%～70%B；5 min～5.1 min，70%～95%B；5.1 min～12 min，95%B；12 min～12.1 min，95%～5%B；12.1 min～15 min，5%B；流速：300 μL/min。

1.2.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子（electron spray ionization，ESI）源；正離子掃描模式；氣簾氣（curtain gas，CUR）：2.4×105Pa；碰撞氣（collision gas，CAD）：High；離子化電壓（ionspray voltage，IS）：4 500 V；輔助氣溫度（Temperature，TEM）：500 ℃；霧化氣（ion source gas1，GS1）：3.8×105Pa；輔助氣（ion source gas2，GS2）：3.8×105Pa；入口電壓（declustering potential，EP）：10 V；碰撞室出口電壓（cell exit potential，CXP）：13 V。多反應監測（MRM）參數設置：各化合物母離子、子離子及能量參數等見表2。

表2 12種真菌毒素的保留時間、母離子、子離子和能量參數Table 2 The retention time，precursor ions，product ions and energy parameters for 12 kinds of mycotoxins

續表2 12種真菌毒素的保留時間、母離子、子離子和能量參數Continue table 2 The retention time，precursor ions，product ions and energy parameters for 12 kinds of mycotoxins

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

采用獨立針泵直接進樣，分別將12種真菌毒素的標準溶液（200 ng/mL）在質譜Manual Tuning模式下進樣分析。由于12種真菌毒素均屬于極性化合物，故選擇適用于中等極性、極性化合物的電噴霧離子（ESI）源。比較化合物母離子在正、負離子模式的響應，綜合考慮，選擇了正離子電離模式。隨后優化了母離子的DP電壓，在Product Ion（MS2）模式下選擇了相對豐度較高的兩個離子分別作為定量離子和定性離子，并在MRM模式下優化了對應離子的CE電壓，CXP電壓等參數，最后連接液相，進一步優化CUR、IS等離子源參數。

圖1 標準品溶液與樣品的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatography of standard solution and rice sample solution

2.2 流動相條件及溶劑的優化

綜合考慮各毒素的pKa值，化合物的電離及加氫離子的形成等因素，比較了在流動相中加入0.1%、0.2%、0.5%甲酸相應的化合物強度，最終選擇0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相。標準品溶液和大米樣品的的總離子流圖見圖1；標準品溶液的子離子圖見圖2。

圖2 12種生物毒素標準品溶液的總離子圖Fig.2 The total ion chromatography for standard solution of 12 kinds of mycotoxins

2.3.1 基質效應的考察

2.3 樣品前處理方法的考察

本試驗用含10%甲酸的乙腈溶液提取樣品，鹽包鹽析分層，并利用凈化管中MgSO4去除提取液中微量的水，PSA除去樣品中酸性物質或者糖，C18去除脂肪、油等非極性化合物，中性氧化鋁從弱、中極性溶劑中吸附極性雜質，達到凈化樣品的目的。由于商品化的凈化管填料更具均勻性，利于試驗的穩定性，保證結果的重現性，故選擇了商品化的2 mL凈化管。

基質效應是樣品中被分析物以外的組分，會干擾分析物的分析過程及影響分析結果的準確性[19]。在LC-MS檢測中，基質效應主要表現在待測成分的共流物競爭性抑制或增強待測組分的電離，從而干擾其測定，進而影響結果的準確性[20-25]。比較了以15%乙腈溶液、空白樣品提取液配制的混合標準曲線溶液對樣品回收率的影響，結果表明大米、小麥、玉米都存在不同程度的基質效應，有增強也有減弱。在小麥粉中，15%乙腈溶液配制的標準曲線計算FB1添加水平為200μg/kg時其回收率為102%，而用空白樣品提取液配制的標準曲線計算得回收率僅為73%；在玉米粉中，15%乙腈溶液配制的標準曲線計算AFTB1添加水平為2 μg/kg時回收率為42%，而用空白樣品提取液配制的標準曲線計算則回收率為93%。綜合考慮，采用空白樣品提取液配制基質匹配標準溶液。

此外，通過考察樣品經鹽析包、凈化管處理后能消除大部分雜質，但不能去除磷脂干擾。由于稻米、小麥等谷物中存在的磷脂會干擾LC-MS分析、污染色譜柱和UPLC系統、質譜儀，對儀器造成傷害。通過母離子掃描方式（precursor ion），監測大部分磷脂中共存的質荷比為184的碎片離子，研究發現采用Oasis PRiME HLB小柱凈化樣品提取物，可達到去除大量磷脂的目的，減輕磷脂對檢測系統的污染，降低樣品檢測的干擾及提高色譜柱的壽命。樣品提取物經Oasis PRiME HLB凈化前后總離子流圖見圖3。

圖3 樣品提取物經HLB小柱凈化前后的總離子流圖Fig.3 The total ion chromatography of sample extracts solutions before and after purified by HLB cartridges

2.3.2 溶劑效應的考察

溶劑效應是樣品溶劑強度大于流動相強度時造成色譜峰變形的現象，對色譜中出峰時間較早的化合物影響較大[26-29]。溶劑效應雖可通過降低進樣體積達到理想的效果，但出于檢出限的考量，考察了不同比例乙腈作為溶劑時的溶劑效應。吸取500 μL凈化后的上清液，在溫和的氮氣流中揮干，復溶于250 μL不同比例的乙腈溶液中，最終均衡化合物的溶解性，選擇了15%乙腈溶液作為樣品溶劑，這樣既可降低溶劑強度，起到了消除溶劑效應的目的，又減少了樣品的稀釋倍數，提高樣品的儀器響應。不同比例乙腈水溶液濃度對出峰時間最早的DON的影響見圖4。

圖4 溶劑效應圖Fig.4 The chromatography of solvent effect

2.4 線性離子阱（Qtrap）

線性離子阱為離子阱的一種，在傳統的三重四級桿質譜（triple quadrupole mass spectrometer，QQQ）的基礎上，Q3除了離子篩選等功能外，兼具有線性離子阱的離子捕獲、阱集等功能。通過信息依賴性掃描的邏輯選項整合諸如多反應監測（MRM）、中性丟失（neutral loss，NL）、母離子掃描（precursor，Prec）等的探測掃描和增強質譜掃描（enhanced scan，ES）、增強子離子掃描（enhanced product ion，EPI）、增強分辨率掃描（enhanced resolution，ER）、三級質譜掃描（MS3）等觸發掃描，達到在一次采樣中同時獲得兩種或兩種以上不同采集模式的數據的目的[30-34]。研究采用典型的MRM觸發EPI模式，當在MRM模式采樣過程中，一旦某個通道“出現”色譜峰，并且出峰狀況達到預設的要求，質譜將在1 ms內將Q3切換成線性離子阱，并對該通道的母離子執行子離子增強掃描（EPI），獲得它的二級譜圖。由于此二級譜圖為母離子經過線性離子阱的富集后所得，靈敏度得到了很大的提高。即此模式既可實現MRM常規的定量、一般的定性功能，又可對經EPI獲得的更加豐富的特征性二級碎片離子進行進一步的定性確認，大大降低了樣品的假陽性率。利用標準品溶液通過質譜軟件建立了12種真菌毒素的二級碎片譜庫，通過匹配度（purity）便捷的篩查和確證疑似陽性樣品，具體譜圖及特征性離子見圖5和圖6，由圖6可見大米回收樣品中的FB2的二級圖譜與標準溶液中所建的二級圖譜一致。

2.5 方法學驗證

2.5.1 儀器精密度

取系列濃度曲線最低點溶液連續進樣6次，記錄峰面積，并計算其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果表明，RSD 均在 1%以內，符合儀器對精密度的要求。

2.5.2 標準曲線及加標回收率

對基質匹配混合標準曲線溶液進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。分別取大米、小麥、玉米樣品各18份，平均分3組，每組加入不同濃度的混合對照，按1.2.1樣品的前處理操作，然后上機測定，結果見表3。

圖6 大米樣品中FB2與所建譜庫中FB2二級譜圖Fig.6 The fragments of FB2in rice and standard library

表3 12種真菌毒素在3種基質中的加標回收率、精密度（n=6）及儀器檢出限Table 3 Results of recoveries、precision（RSD）and limits of detection（LOD）of 12 mycotoxins in different samples（n=6）

由表3可知，12種真菌毒素在相應濃度范圍內的相關系數均大于0.995，各樣品加標回收率在59%～112%之間，每組的相對標準偏差均小于8%（n=6），個別成分的回收率偏低，可能是由于基質效應的影響，或者提取過程中諸如固體分散相的吸附，提取溶液的酸堿度影響，有待進一步考察。

2.5.3 穩定性

回收樣品溶液分別放置 0、12、24、48、72、96 小時后進行測定，計算各真菌毒素峰面積的RSD均在2%內，表明各真菌毒素可在回收樣品溶液中穩定保存。

2.5.4 儀器檢出限

以基質匹配混合標準曲線溶液的最低點進樣，信噪比均大于3，計算信噪比為3時化合物的濃度即為儀器檢出限。玉米基質的儀器檢出限見表3。

2.6 實際樣品的檢測

本研究方法與國家標準要求方法對2017年的部分監督抽樣樣品進行平行測定，兩者結果基本一致。其中2批疑似檢出AFB1的樣品，通過譜庫的匹配與特征離子的校對，排除了陽性結果的可能。

3 結論

本研究主要針對谷物中較具代表性的大米、玉米、小麥基質，建立12種真菌毒素的UPLC-Q-trap MS高通量篩查和定量方法，該方法操作簡便，安全，準確性高，重復性好，利用線性離子阱的功能，增強化合物二級碎片離子的靈敏度，在準確定量的同時，定性功能進一步加強，有助于假陽性樣品的排除，利于食藥領域的監督管理，為食藥安全提供有力的技術支持。