GC-MS/MS法測定飲用水中2種鹵代酸殘留量

胡松，陳盧濤，周婷婷，俞璐萍，黎斌，劉小羽，胡晉峰，朱萌萌，*

（1.綠城農科檢測技術有限公司，浙江杭州310000；2.安徽農業大學茶與食品科技學院茶葉生物與利用國家重點實驗室，安徽合肥230036）

國內采用氯氣消毒是最主要的消毒方式[1]，70年代以來，人們已經發現氯化消毒副產物（disinfection by-products，DBPs）與人類癌癥的發生有密切的相關關系，且消毒副產物中鹵乙酸含量約占DBPs的50%左右，而二氯乙酸（dichloracetic acid，DCAA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCAA）是飲用水加氯消毒的副產物鹵乙酸之一，其具有不易揮發、沸點高、致癌風險大等特點，其中DCAA和TCAA的致癌風險分別是三鹵甲烷的50倍和100倍，已被美國國家環境保護局（Environmental Protection Agency，EPA）定義為人類潛在的致癌物[2]。世界各國對飲用水中氯乙酸規定了相應濃度限值，我國GB 5749-2006《生活飲用水衛生標準》中規定DACC、TCAA的含量分別不得超過50、100 μg/L；美國飲用水水質標準中規定鹵乙酸總量不得超過60 μg/L；日本規定了DCAA、TCAA的含量分別不得超過30、40 μg/L；澳大利亞規定了DCAA、TCAA的含量分別均不得超過100 μg/L[3]。

目前國內外鹵乙酸的檢測分析方法主要包括氣相色譜法（gas chromatography-hydrogen flame ionization detector，GC-ECD）[4-5]，氣相色譜質譜法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）[6-8]，離子色譜法[9-11]，高效液相色譜法[12]，液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[1，13]等。由于鹵乙酸具有較強的極性，采用氣相法檢測通常需要先進行衍生化反應；液相色譜及液相色譜串聯質譜法可以無需經過衍生化過程，大大縮短分析時間，但其檢出限較高，為0.1 mg/L～1.0 mg/L[14]；離子色譜法具有操作簡單，測定迅速等優點，但該方法靈敏度低[3]。近年來，許多研究人員在前處理方法上進行各種改進，優化，或采用固相微萃取方式對鹵乙酸進行富集，但效果不太明顯。劉天潔[4]采用硫酸-甲醇溶液結合GC-ECD對DACC、TCAA的前處理過程進行優化，最終衍生條件為60℃烘箱衍生90 min，縮短了反應時間。三甲基硅重氮甲烷（trimethylsilyl diazomethane，TMS-CHN2） 是重氮甲烷的安全性替代物，已廣泛被應用于苯氧羧酸類除草劑、酚類化合物[15]的衍生化反應上。本文擬采用優化后的TMS-CHN2衍生化前處理方法結合氣相色譜-串聯質譜 （gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）方法，探討兩種衍生化試劑用于生活飲用水中二氯乙酸、三氯乙酸殘留量分析的差異，旨在探究一種操作簡單、快捷高效、檢出限低的前處理及衍生化方法，用于飲用水中痕量二氯乙酸、三氯乙酸殘留量的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氯乙酸、三氯乙酸標準品：1 000 μg/mL，農業部環境保護科研監測所；三甲基硅重氮甲烷（TMSCHN2、純度≥96.0%）、2.0 mol/L己烷溶液：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇：色譜純，美國J.T.Baker公司；濃硫酸：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；甲基叔丁基醚：≥99.0%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；碳酸氫鈉、氯化銨、無水硫酸鈉：上海安譜實驗科技股份有限公司；試驗所用水均為去離子水；微孔有機濾膜：0.22 μm；棕色帶聚四氟乙烯襯墊的螺口塞采樣瓶；娃哈哈純凈水、屈臣氏蒸餾水：市售。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-串聯質譜儀：GC-2010 plus氣相色譜儀配TQ8040質譜儀，DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），日本 Shimadzu公司；MTN-5800 氮吹儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；CHK-121臺式精密酸度計：北京昌科儀自動化科技有限公司；ST-16R離心機：美國Thermo Fisher公司；BSA2202S電子天平：德國Sartorius公司；talboys數顯型漩渦混合器：美國Henry Troemner公司；V-700型旋轉蒸發儀：瑞士Buchi公司；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

進樣口溫度：200℃；載氣：高純氦氣；碰撞氣：高純氬氣，純度≥99.999%；柱流量：1.2 mL/min；進樣方式：不分流進樣，1.0 min 后開閥；進樣量：1 μL；定量方法：外標法；升溫程序：40℃保持1 min，以9℃/min升至130℃，以40℃/min升至150℃，保持3 min；

1.3.2 質譜條件

色譜-質譜接口溫度：200℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；檢測器電壓：0.99 kV（+0.4 kV）；測定方式：多重反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；定性、定量離子、碰撞能量等參數見表1。

表1 二氯乙酸、三氯乙酸質譜檢測參數Table 1 The MS/MS parameters of dichloracetic acid and trichloroacetic acid

1.4 試驗步驟

1.4.1 提取

采集到的水樣，使用棕色的帶聚四氟乙烯襯墊的螺口塞采樣瓶于4℃冰箱中保存。量取25.00 mL水樣于50 mL離心管中，加入2.0 mL濃硫酸（調節pH≤0.5），搖勻后，再加入10.0 g無水硫酸鈉，渦旋1.0 min，加入5.0 mL甲基叔丁基醚，渦旋器振蕩5.0 min，靜置30 min待有機相和水相分層，移取有機相至10 mL具塞刻度管中，緩緩氮氣吹至近干，待衍生。

1.4.2 衍生化

1）向上述提取液中加入硫酸-甲醇溶液（體積比，20∶80）2.0 mL，蓋上瓶塞，在50℃水浴條件下反應2.0 h，取出具塞刻度管并冷卻至室溫，逐滴加入2.0 mL飽和碳酸氫鈉溶液以中和pH，加入1.0 mL甲基叔丁醚，渦旋1.0 min，取有機相過0.22 μm濾膜并轉移至樣品小瓶，待凈化[16]。

2）向上述提取液中加入衍生化試劑三甲基硅重氮甲烷（TMS-CHN2）40μL，蓋上瓶塞，渦旋1.0min，在30℃水浴條件下反應20.0 min，加入1.00 mL甲基叔丁基醚提取衍生后產物，渦旋后離心取上清液，待凈化。

1.4.3 凈化

先用5.0 mL正己烷預淋洗Florisil固相萃取柱，將上述待凈化液轉移至小柱上，再用10.0 mL甲基叔丁基醚溶液進行洗脫，收集全部流出液，在常溫條件下氮氣流吹至近干，用正己烷溶解并定容至1.0 mL，供氣相色譜-串聯質譜檢測。

1.4.4 標準溶液的配制

稱取二氯乙酸、三氯乙酸1.00 mL，用甲基叔丁基醚定容至25.0 mL，得到40.0 mg/L標準儲備溶液；用甲基叔丁基醚稀釋為5.00 mg/L的標準工作溶液，于0℃～4℃保存。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜-質譜條件的優化

在電子轟擊離子源（electron bombardment ion source，EI）檢測模式下對二氯乙酸、三氯乙酸甲酯后產物進行一級質譜分析（Q3 Scan），在質譜圖中選擇質荷比較大，絕對強度較大的離子為前體離子；設定3eV～45 eV（每3 eV一個間隔）的碰撞能量，對選定的前體離子峰進行二級質譜分析（產物離子掃描），根據二級質譜圖，選擇離子強度最大的為定量離子，離子強度次之的為定性離子。圖1為使用優化后的氣相色譜質譜條件采集二氯乙酸（2.00 mg/L）、三氯乙酸（2.00 mg/L）標準溶液MRM質譜圖。

圖1 二氯乙酸、三氯乙酸MRM色譜圖Fig.1 Chromatogram of dichloracetic acid and trichloroacetic acid in multiple reactions monitoring mode（MRM）

2.2 三甲基硅重氮甲烷（TMS-CHN2）衍生條件優化

二氯乙酸、三氯乙酸具有較高的沸點（＞190℃）和一定的極性，在水中難揮發且強酸性和極性會引起在色譜柱上吸附，通常需要衍生化反應后再進行氣相色譜質譜分析，本試驗比較了兩種衍生化試劑：硫酸-甲醇溶液和TMS-CHN2己烷溶液對二氯乙酸、三氯乙酸兩種鹵代酸衍生化反應的效率和適宜性。

2.2.1 TMS-CHN2添加量考察

在具塞玻璃離心管中分別加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸兩種標準儲備液0.400 mL，添加衍生化試劑 TMS-CHN2己烷溶液體積分別為 20、40、60、80、100 μL，在室溫條件下，氮氣流緩緩吹干有機溶劑，按照1.4.2中第二種衍生化方法進行衍生，并將最終體積定容為1.0 mL上機分析。結果表明（見圖2），隨著TMS-CHN2添加量的增加，二氯乙酸、三氯乙酸衍生化產物響應逐漸提高，當添加量增加到40 μL時，衍生化產物響應最高。繼續增加TMS-CHN2己烷溶液的添加量，衍生化產物的響應呈穩定趨勢。綜合考慮，為保證衍生化反應完全，同時可以有效降低試驗成本，選擇TMS-CHN2己烷溶液的添加體積為40 μL。

圖2 TMS-CHN2添加量對衍生化效率的影響Fig.2 The effects of the additives of TMS-CHN2on the derivatization

2.2.2 衍生化時間的考察

在具塞玻璃離心管中分別加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸兩種標準儲備液0.400 mL，添加優化后的衍生化試劑TMS-CHN2己烷溶液體積40 μL，在室溫條件下，氮氣流緩緩吹干有機溶劑，按照1.4.2中第二種衍生化方法進行衍生，分別設置衍生化時間為10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 min，并將最終體積定容為 1.0 mL上機分析。結果表明（見圖3），隨著衍生化時間的延長，衍生后產物的響應逐漸增強；當衍生化時間為20.0 min時，衍生后產物響應最高；當繼續延長衍生化時間，衍生化產物響應稍有降低。綜合考慮，為保證衍生化產物響應，同時可以有效節約試驗時間，選擇TMS-CHN2己烷溶液衍生化時間為20.0 min。

圖3 不同衍生時間對衍生化效率的影響Fig.3 The effect of different derivative time on derivative efficiency

2.2.3 衍生化時間的考察

在優化好的衍生試劑添加量（40 μL）及衍生時間（20.0 min）基礎上，對衍生化溫度進行考察。在具塞玻璃離心管中分別加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸兩種標準儲備液0.400 mL，添加優化后的衍生化試劑TMS-CHN2己烷溶液體積40 μL，在室溫條件下，氮氣流緩緩吹干有機溶劑，按照1.4.2中第二種衍生化方法進行衍生，分別設置衍生化溫度為20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0℃，并將最終體積定容為1.0 mL上機分析。結果表明（見圖4），從20℃開始，隨著水浴溫度的提高，兩種鹵代酸的響應逐漸增強，在30℃時響應最強。水浴溫度逐漸升高，兩種鹵代酸的響應快速降低，由于正己烷沸點較低，在40℃及以上溫度時，可明顯看到具塞刻度管上層有明顯黃色氣體，可能由于正己烷的揮發帶動TMS-CHN2與樣品接觸較少，衍生化反應不完全導致，因此，選擇TMS-CHN2己烷溶液的最佳衍生化溫度為30℃。

圖4 不同衍生溫度對衍生化效率的影響Fig.4 The effect of different derivative temperature on derivative efficiency

2.3 硫酸-甲醇溶液和TMS-CHN2兩種衍生化試劑比較

參照GB/T 5750.10-2006《生活飲用水標準檢驗方法消毒副產物指標》及李志華等優化后的硫酸甲醇溶液衍生條件（即1.4.2），確定TMS-CHN2最佳添加量及衍生化時間的條件后，比較兩種衍生化試劑在最佳添加量下對相同濃度的二氯乙酸、三氯乙酸衍生化效率。在具塞玻璃離心管中分別加入5.0 mg/L的二氯乙酸、三氯乙酸兩種標準儲備液0.400 mL，在室溫條件下，氮氣流緩緩吹干有機溶劑，分別按照1.4.2中1）和2）的衍生化方法進行衍生化反應。結果表明（見圖5），在相同的儀器分析條件下，二氯乙酸經TMS-CHN2衍生后的響應是經硫酸-甲醇溶液衍生后響應的1.69倍，三氯乙酸經TMS-CHN2己烷溶液衍生后的響應是經硫酸-甲醇溶液衍生后響應的1.71倍。烷基化試劑主要由重氮甲烷、烷基鹵、醇類等組成，其中重氮甲烷使用最廣泛，且反應迅速、高效、無副產物，但其毒性大，不易保存，現經常被TMS-CHN2所代替，TMS-CHN2是重氮甲烷的安全性替代物，已廣泛被應用于苯氧羧酸類除草劑、酚類化合物的衍生化反應上。兩種衍生化試劑經比較可發現，TMS-CHN2己烷溶液在二氯乙酸、三氯乙酸的衍生化反應上，較常規硫酸-甲醇溶液衍生時間更短、衍生試劑量更少，衍生產物響應更高，操作也更為方便、簡單，可以替代硫酸-甲醇溶液用于二氯乙酸、三氯乙酸的檢測。

圖5 兩種衍生化試劑比較（n=3）Fig.5 The comparison of two derivatization reagents（n=3）

2.4 方法的線性范圍、加標回收率、精密度和定量限

分別取5.0 mg/L二氯乙酸、三氯乙酸混合溶液25、50、100、200、500、1 000 μL 于 25 mL 容量瓶中，分別用純凈水定容至25.0 mL，配制后工作曲線的質量濃度分別為：5.0、10.0、20.0、40.0、100、200 μg/L。按 1.4 的方法進行萃取、衍生、分析，按優化色譜條件進樣1 μL，以峰面積為縱坐標，標準樣品的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程及相關系數見表2，以信噪比S/N≥3估算儀器的檢出限（limit of determination，LOD），S/N≥10估算儀器的定量限（limit of quantitation，LOQ），結果見表 2。

表2 二氯乙酸、三氯乙酸化合物的線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficient，limit of determination（LOD）and limit of quantitation（LOQ）of dichloracetic acid and trichloroacetic acid

分別量取自來水、娃哈哈純凈水、屈臣氏蒸餾水3個樣品25.0 mL，分別添加0.02、0.04、0.1 mg/L不同水平的二氯乙酸、三氯乙酸標準溶液進行回收率試驗，每個添加水平重復3次，加標回收結果見表3。

二氯乙酸、三氯乙酸的平均回收率范圍為86.1%～96.5%，相對標準偏差小于5.2%，符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F中對檢測方法確認的要求。

3 結論

本試驗第一次建立了三甲基硅重氮甲烷（TMSCHN2）結合氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）用于二氯乙酸、三氯乙酸衍生化反應的檢測方法，比較了硫酸-甲醇溶液、三甲基硅重氮甲烷（TMS-CHN2）兩種衍生化試劑用于二氯乙酸、三氯乙酸衍生化反應的優劣。兩種試劑均可用于二氯乙酸、三氯乙酸的衍生化反應檢測，TMS-CHN2己烷溶液在二氯乙酸、三氯乙酸的衍生化反應上，將衍生化反應時間從120 min縮短為20 min，較常規硫酸-甲醇溶液衍生時間更短、衍生試劑量更少，衍生產物響應更高，且添加回收試驗結果精密度更高，操作也更為方便、簡單。采用優化后的GC-MS/MS方法，在空白樣品添加濃度為0.02、0.04、0.1 mg/L的范圍內，二氯乙酸、三氯乙酸的平均回收率范圍為86.1%～96.5%，相對標準偏差小于5.2%，符合GB/T 27404-2008附錄F中對檢測方法確認的要求。因此優化后的該方法檢出限低、靈敏度高，適用于生活飲用水中二氯乙酸、三氯乙酸定量檢測。

表3 二氯乙酸、三氯乙酸化合物的加標回收率及相對標準偏差（n=3）Table 3 Recoveries and RSD of dichloracetic acid and trichloroacetic acid in cabbage and citrus（n=3）