異常威克漢遜酵母的麩曲制作工藝優化

夏玙，謝軍，黃丹，羅惠波，2，*，楊文斌

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000；3.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都611700）

被稱為“酒之骨”的曲，其創新和發展一直處于重要地位[1]。麩曲制作屬熟料制曲范疇[2]。麩曲制作在于新菌種開發應用，保持功能菌性狀穩定，制作技術創新等方向上努力改進[3]。酵母麩曲以麩皮為原料，蒸熟后接入純種酵母，人工培養的酶制劑[4]。現階段，多數采用將霉菌、酵母應用到麩曲中，用大曲與麩曲混合、小曲與麩曲混合的方法來提高白酒的品質[5]。目前，鮮有純種酵母麩曲的相關報道。

早年，對麩曲原料研究較多。趙希玉等[6]以麩皮為培養基，加少量玉米面，并添加少量鮮酒糟調節酸度，對生香酵母的培養溫度控制在34℃～37℃之間，培養時間48 h。麩曲制作常用熟料，為了節省一部分成本，尹召軍等[7]采用生料、熟料混合配制根霉麩曲，生熟料之比（質量比）為4∶6，麩曲接種量為0.8%，水分含量為50%。對不同菌種的麩曲制作也是研究的一大方向。武順等[8]采用響應面法對產吡嗪細菌的麩曲制作工藝進行了優化研究。郭凱凱等[9]將高產酯釀酒活性干酵母用于清香麩曲酒中，提高了乙酸乙酯和總酯的含量，酒質得到提升。姜鵬[10]將酵母菌S1并制成麩曲，按所需小麥總重量的0.5%、1%添加到粉碎后原料中，制成高酯強化大曲，其白酒出酒率、優質品率、原酒總酸和總酯量均得到有效提高。本試驗以酵母w2在麩曲中的活菌總數為檢測指標，優化酵母麩曲制作中原料配比和培養條件的工藝，并初步應用于小曲清香酒。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母w2：異常威克漢遜酵母（wickerhamomyces anomalus），濃香型大曲篩選分離所得；YPD培養基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，葡萄糖 10 g，瓊脂 10 g；孟加拉紅培養基：蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，氯霉素0.1 g，硫酸鎂0.5 g，葡萄糖10 g，孟加拉紅0.032 g，瓊脂18.5 g；9%生理鹽水；麩皮、鮮酒糟、玉米粉：市售。

1.2 儀器及設備

LS-I201微生物培養箱：飛世爾實驗器材（上海）有限公司；EWYR-D2403恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HT300A自動固相微萃取儀：意大利HTA公司；Agligent 7890A-5975B型氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母麩曲原料配比用量確定方法

試驗酵母麩曲原料主要為麩皮、玉米粉、鮮酒糟。為研究酵母w2在酵母麩曲不同原料配比下的生長情況，三角瓶小試以各單因素梯度變化，從而確定出酵母w2的麩曲原料配比。

1.3.1.1 麩皮用量確定

配制麩皮用量梯度的酵母麩曲：現稱量麩皮分別為 4、6、8、10、12、14、16 g，玉米粉均為 2 g，鮮酒糟均為4 g于250 mL三角瓶中，水分20%。121℃條件下，滅菌30 min。采用10%的接種量，將酵母w2種子液接種到不同麩皮量的三角瓶中，用玻璃棒充分攪拌均勻，4層紗布封蓋，給予足夠的通氧量。置25℃的恒溫培養箱中培養36 h。

1.3.1.2 鮮酒糟用量確定

稱量鮮酒糟分別為 1、2、3、4、5、6、7、8 g，麩皮均為10 g，玉米粉均為2 g于250 mL三角瓶中，水分20%。無菌操作，按10%的接種量。培養方式同1.3.1.1。

1.3.1.3 玉米粉用量確定

稱量玉米粉分別為 0、1、2、3、4、5、6、7 g，麩皮均為10 g，鮮酒糟均為4 g于250 mL三角瓶中，水分20%。采用10%的酵母接種量。培養方式同1.3.1.1。

1.3.2 酵母麩曲培養條件的優化

應用1.3試驗結果所得到的酵母麩曲的最佳原料配比，研究應用此原料配比的酵母麩曲，在不同水分含量、培養時間、培養溫度下酵母的最佳生長量。

1.3.2.1 不同水分含量對酵母生長量的影響

接種10%酵母w2種子液在水分含量（質量分數）分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的酵母麩曲原料配方中。給予足夠的通氧量，放置25℃恒溫培養箱中培養36 h。

1.3.2.2 不同培養時間對酵母生長量的影響

采用10%接種量，水分含量為20%，麩曲原料配比同1.3.2.1。將接種好的酵母麩曲放置在25℃培養箱中，分別培養 12、24、36、48、60、72 h。

1.3.2.3 不同培養溫度對酵母生長量的影響

采用10%的接種量，水分含量為20%。將已接種的酵母麩曲分別放置于 12、16、20、24、28、32、36 ℃溫度的微生物培養箱中，培養36 h。

1.3.3 酵母麩曲活菌計數方法

制作菌懸液：每個樣稱量10 g酵母麩曲加入裝有90 mL無菌9%生理鹽水的250 mL三角瓶中，于恒溫培養振蕩器中28℃、100 r/min振蕩30 min。菌液梯度稀釋：無菌操作，取5支已滅菌裝有9 mL 9%生理鹽水的試管，依次稀釋為 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的菌懸液，用移液管分別移取1 mL菌懸液逐級稀釋。涂布平板法：分別移取每個樣品10-6濃度的菌液1 mL于孟加拉紅平板培養基中，涂布后放置28℃恒溫培養箱中培養36 h后，用菌落計數儀計數。

1.3.4 揮發性風味物質檢測方法

酵母發酵液和酒液中揮發性風味物質的檢測均采用此方法。固相微萃取條件：精確量取5 mL，55℃平衡10 min后萃取30 min。氣相色譜條件：DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管色譜柱；進樣口溫度230℃；不分流；程序升溫，40℃保持1 min，5℃/min升到200℃，再以10℃/min升到230℃保持1 min；載氣為99.999%氦氣，載氣流速為1 mL/min。質譜條件：電離電壓70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離方式EI，質量掃描范圍20 amu～500 amu，溶劑延遲3 min。

1.3.5 釀酒試驗

采用清香型小曲酒工藝，以2%的添加量，將最佳工藝酵母麩曲分別在糖化前（a）、糖化后（b）加入發酵糟中，以不加酵母麩曲為對照。工藝流程如下：

1.3.6 數據處理及圖像處理方法

試驗所得數據采用origin、Excel作圖，SPSS 20.0進行方差分析，多重比較采用Duncans新復極差法進行差異顯著性的分析，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 酵母w2揮發性風味代謝產物分析

對酵母w2液態發酵液進行代謝產物分析，如圖1所示。

酵母w2代謝的主要產物為酯類、醇類物質，以乙酸乙酯、乙醇、苯乙醇、異戊醇、乙酸苯乙酯為主，相對含量分別為 49.008%、32.893%、6.619%、4.972%、2.928%。乙酸乙酯有水果香味，異戊醇有蘋果白蘭地和辛辣味，乙酸苯乙酯有甜蜜香味，苯乙醇有密香玫瑰味。酵母w2具有豐富的香甜味，可以應用到相應的酒等食品類，具有較高的風味價值。乙酸乙酯是清香型白酒的主體香，香味清新甜潤，此酵母如能應用到清香型白酒中，能起到很好的提酯提味的效果，具有較高的應用開發潛質。

圖1 酵母w2代謝產物GC-MS離子流色譜Fig.1 The GC-MS ion chromatography of metabolite by yeast w2

2.2 酵母麩曲原料用量單因素試驗

張東平[11]對根霉酵母麩曲在白酒中的應用所用到的原料配比為：麩皮50%，鮮酒糟30%，玉米粉20%。黃光建等[12]對香醅配料進行優化，結果表明麩皮和鮮酒糟對酵母產酯的影響比較大，而玉米粉的影響不是太大。為了研究酵母w2在麩曲中應用，以酵母活菌數為衡量指標，得到酵母w2麩曲的原料配比。

2.2.1 麩皮用量確定

麩皮富含淀粉、維生素及無機鹽等營養成分，且疏松多孔，有利于麩曲中酵母的生長代謝和通氧散熱等。本試驗對變量麩皮應用到酵母麩曲的結果如圖2所示。

圖2 麩皮添加量對酵母活菌數的影響Fig.2 The influence of amount of bran to viable count of yeast w2

由圖2知，當麩皮添加量為6 g時，酵母活菌數顯著高于其他麩皮添加量，其數量為1.27×108CFU/g，相當于其他添加量活菌數的1.6倍左右，在其他添加量下無顯著差異。故可考慮酵母麩曲中麩皮用量占比為50%（6 g/12 g）。

2.2.2 鮮酒糟用量確定

鮮酒糟含有豐富的粗蛋白，同時還含有多種微量元素、維生素、氨基酸、還原糖等。將鮮酒糟應用于酵母麩曲的原料中，可為酵母提供較為豐富的營養料。本試驗對變量鮮酒糟應用到酵母麩曲的結果如圖3所示。

圖3 鮮酒糟添加量對酵母活菌數的影響Fig.3 The influence of amount of fresh distillers grains to viable count of yeast w2

由圖3知，隨著鮮酒糟添加量的增加，酵母活菌數逐漸增加；而隨著鮮酒糟添加量的繼續增加超過一定數量，酵母活菌數呈顯著下降趨勢，而鮮酒糟過剩（＞33.3%）會抑制部分酵母的生長。由此可知，一定量的鮮酒糟有利于酵母麩曲中酵母的生長。當鮮酒糟為4 g或5 g時，酵母活菌數無明顯差異性且最有利于酵母w2的生長，可考慮鮮酒糟添加量為25%（4 g/16 g）～29.4%（5 g/17 g）范圍內。

2.2.3 玉米粉用量確定

酵母的生長繁殖需要一定的碳源，玉米粉在微生物發酵中主要起碳源的作用，其中玉米粉還含有較多的生長因子。劉曉明等[13]研究酵母對不同碳源（包括玉米粉、麩皮、豆面、葡萄糖）的利用效果，結果表明玉米粉對酵母發酵為最佳碳源。本試驗探究玉米粉用量對酵母生長的影響，試驗結果如圖4所示。

如圖4，少量的玉米粉有利于酵母麩曲中發酵的酵母生長，其酵母活菌數幾乎多了2倍。所以，玉米粉雖作為酵母必不可少的碳源，但只能是適量。當玉米粉的添加量達到4 g時，酵母活菌數最多，高達1.66×108CFU/g。可考慮酵母麩曲中原料玉米粉的占比為22%（4 g/18 g）。

綜上所述，考慮取酵母w2麩曲的原料配比為（以總質量20 g計）：麩皮 50%（10 g），鮮酒糟 28%（5.6 g），玉米粉 22%（4.4 g）。

圖4 玉米粉添加量對酵母活菌數的影響Fig.4 The influence of amount of corn powder to viable count of yeast w2

2.3 酵母麩曲培養條件優化

通常制曲講究培菌的工藝條件控制，一些主要的條件控制有溫度、水分、時間、通氧量等[14]。本試驗通過分別控制單因數的變量，探究酵母麩曲的質量的最佳培菌工藝條件。

2.3.1 水分含量對酵母生長量的影響

水分是微生物生長繁殖發酵代謝必不可少的資源之一，通常較高的濕度會有利于酵母的生長[15]，但水分過多也會相應的抑制微生物的生長。控制酵母麩曲的水分含量試驗結果如圖5所示。

圖5 水分含量對酵母活菌數的影響Fig.5 The influence of moisture content to viable count of yeast w2

如圖5所示，當麩曲中水分含量只有5%時，酵母的活菌數只有1.5×108CFU/g，顯著少于其他水分含量梯度的酵母量；隨著水分含量的增加，其活菌數顯著增加一倍并能維持在一定的數量；水分含量繼續升高，當達到35%時，酵母活菌數達到峰值。酵母麩曲中單因素水分含量控制在35%左右，更利于酵母的生長。

2.3.2 不同培養時間對酵母生長量的影響

對酵母麩曲培養時間的控制，得到的結果如圖6所示。

圖6 培養時間對酵母活菌數的影響Fig.6 The influence of time to viable count of yeast w2

由圖6可知，當酵母麩曲培養12 h時，酵母的生長很慢，隨著培養時間的增加，當達到24 h時，此時酵母活菌數顯著增加；培養時間繼續增加，麩曲中酵母數量下降并能維持在一定數量值上，此時酵母生長穩定。培養時間為24 h左右，酵母w2生長良好。

2.3.3 不同培養溫度對酵母生長量的影響

微生物培養最講究控溫工藝，溫度為曲藥培菌的一大重要指標[16]。曲中各類微生物生長繁殖發酵代謝中溫度的變化，使得在制作過程中可大致知道此曲的發酵程度甚至認為控制發酵而提高其質量。而酵母麩曲作為純種曲，其溫度的控制上較為容易。其培養溫度對酵母生長量的影響結果如圖7所示。

酵母w2生長所需溫度一般在16℃～36℃之間，故主要在低溫培菌期存活繁殖。如圖7所示，隨著溫度上升，麩曲中酵母的活菌數逐漸上升，當溫度達到28℃時，其活菌數最多可達到1.69×108CFU/g；隨著溫度的繼續上升，酵母菌數量顯著下降。培養溫度為28℃左右，酵母w2生長良好。

2.3.4 酵母麩曲培養條件正交優化

對單因素培養條件試驗結果的基礎上，進行四因素三水平L9（34）正交優化，以酵母麩曲中酵母w2活菌數為指標，進行正交數據分析，確定酵母麩曲的最佳培養條件，其分析結果如表1所示。

圖7 不同培養溫度對酵母活菌數的影響Fig.7 The influence of temperature to viable count of yeast w2

表1 酵母麩曲培養條件正交優化Table 1 The orthogonal optimization of yeast bran koji culture conditions

由表1可知，水分含量、時間、溫度對酵母麩曲均有不同程度的影響。R值越大，代表了該因素的水平變化對酵母活菌數的影響較大，由極差分析得RA＞RC＞RB，其中水分和溫度2種因素水平變化引起的極差（11.300和4.667）大于空白列的誤差，說明對酵母麩曲中活菌數變化影響因數的主次順序是：水分＞溫度＞時間。對于 A 因素（水分）：K3＞K2＞K1，所以選 K3為 A 因素的優水平；同理對于 B 因素（時間）：K1＞K3＞K2，所以選K1為 B 因素的優水平；對于 C 因素（溫度）：K3＞K1＞K2，所以選K3為C因素的優水平。故，理論上最佳培養方案為A3B1C3，即水分含量40%，培養溫度30℃，培養時間18 h。

2.4 酵母麩曲驗證試驗

對正交試驗結果進行驗證試驗，試驗結果如表2。

表2 酵母麩曲驗證試驗結果Table 2 The verification experiment result of yeast bran koji

由表2可知，在最佳理論培養條件下進行驗證試驗，得到理論最佳培養條件下酵母活菌數為（473±5.3）×106CFU/g，優于此前的試驗結果，確定最佳培養方案為A3B1C3。在同培養條件下，比較試驗1、2號，酵母w2應用于優化麩曲配方（相比原配方），其酵母活菌數可達到（312±4.8×106）CFU/g，增長了 57.58%；在同麩曲配方下，比較試驗2、3號，優化條件相比原條件，酵母活菌數增長了51.60%。綜上所述，酵母w2應用于麩曲中，其最佳原料配比和最佳培養條件均可行。

2.5 應用于清香型小曲酒釀酒試驗

將工藝優化后的酵母麩曲，比較糖化24 h前、后的加入酵母麩曲進行發酵的小曲清香酒，將蒸餾后的酒液進行檢測，結果如圖8。

圖8 酵母w2的釀酒發酵試驗結果Fig.8 The results of fermentation test with the yeast w2

糖化前添加酵母麩曲使苯乙醇的量增加2倍，但總酯含量有所下降；糖化后添加酵母麩曲可使酒中的乙酸乙酯的含量提高3倍左右，總酯的含量提高2倍左右，苯乙醇含量無顯著變化。酵母麩曲在清香型小曲白酒發酵中的產香促進作用，特別在糖化后加入，效果更佳。

3 結論

將產乙酸乙酯的酵母w2應用到清香型小曲白酒中，使原酒中乙酸乙酯和總酯含量得到明顯提高，清香風格更加突出。通過單因素試驗分析了不同原料和培養條件對酵母麩曲中活菌數的影響，并結合正交試驗設計優化了培養條件，通過驗證試驗說明了優化后原料配比和培養條件的可靠性，確定酵母麩曲的原料配比為：麩皮10 g、鮮酒糟5.6 g、玉米粉4.2 g；酵母麩曲的培養條件為：水分40%，培養時間18 h，培養溫度30℃。本試驗是建立在小試的基礎上初步探究酵母w2的麩曲制作工藝，但應用效果明顯，為進一步探究提供了試驗數據基礎。