外源EBR對芥菜下胚軸伸長的影響

朱磊　武向斌　李勝利　李嚴曼

摘 要： 油菜素內酯（BR）是一種植物激素，具有調控植物生長發育的作用。以芥菜為材料，采用外源2，4-表油菜素內酯（EBR）、乙烯利（Ethephon）、萘乙酸（NAA）等不同生長調節劑進行處理，初步研究了BR在芥菜下胚軸生長中的調控作用。研究發現，外源EBR處理在光照條件下可以促進芥菜下胚軸的伸長，而暗處理下卻抑制下胚軸的生長；EBR與NAA協同促進下胚軸的伸長，EBR可以緩解Ethephon對下胚軸伸長的抑制作用，但EBR促進乙烯的合成。綜上表明，光信號參與調控BR對下胚軸生長的調控作用，同時BR與乙烯、NAA等信號途徑共同參與下胚軸的生長調控。

關鍵詞： 芥菜；油菜素內酯；下胚軸；乙烯；萘乙酸

The effect of exogenous EBR on the hypocotyl elongation in leaf mustard

ZHU Lei，WU Xiangbin， LI Shengli， LI Yanman

（College of Horticulture， Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： Brassinolide （BR） is a kind of plant hormones that has a function in regulating plant growth and development. In this paper， exogenous 2， 4 -brassinolide （EBR）， Ethephon and naphthylacetic acid （NAA） were used to explore the effects of brassinolide on the hypocotyl elongation of mustard seedlings. It was found that EBR could promote the mustard hypocotyl elongation under light conditions， while it had an inhibition effect under dark conditions. EBR and NAA had a synergistic promoting effect on the hypocotyl elongation. EBR could alleviate the inhibition effect of Ethephon on the hypocotyl elongation of mustard seedlings， but it could promoted the synthesis of ethylene. The results indicated that the light signal was involved in the regulation of hypocotyls growth by BR， at the same time， BR， ethylene and NAA signaling pathways were all involved in the regulation of the hypocotyl growth.

Key words： Mustard； Brassinolide； Hypocotyl； Ethylene； Naphthylacetic acid

芥菜（Brassica juncea）的分布遍及我國各地，長江以南地區種植尤為廣泛，在我國有2 000多年的栽培歷史，是我國重要的鮮食和加工蔬菜[1]。芥菜是十字花科蕓薹屬一年生或二年生草本植物，起源于中國，種類繁多，具有豐富的遺傳背景。

油菜素內酯又稱蕓薹素內酯，是繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯之后的第六大類植物激素。研究發現，油菜素內酯不僅在植物的生長發育過程中發揮重要的調控作用，還參與植物對逆境的抗性[2-5]。近年來關于油菜素內酯促進植物種子伸長及油菜素內酯與其他植物激素相互關系的報道也日見增多[6-9]。天然的油菜素內酯不僅可以促進檸條和紫穗槐種子發芽，同時對下胚軸切段伸長有明顯促進作用[10]。豆類中的研究也發現，天然油菜素內酯處理后，黃豆、綠豆種子不僅發芽率提高，同時芽苗胚軸也明顯伸長[11]。

研究發現，BR可以直接參與細胞發育過程，通過影響細胞的增殖和細胞分裂最終調控植物的生長發育[12]。BR與IAA信號途徑互作實現對下胚軸的調控作用，BZR1蛋白可以直接結合在IAA19和ARF7的啟動子區域，進而調控下胚軸的發育[13]。Bokyung Kim等[14]研究發現，BZR1蛋白的穩定性受光照的調控，進而調控下胚軸的伸長。以上的報道多集中于模式植物擬南芥中，芥菜是異源四倍體（AABB），同模式植物擬南芥相比具有更為復雜的表達模式和調控網絡，因此筆者以芥菜為研究對象，通過不同濃度的外源油菜素內酯及其他激素的組合處理研究了芥菜幼苗的下胚軸伸長特性，為今后深入了解油菜素內酯對芥菜下胚軸伸長生長的精細調控機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2015年3月至2016年9月進行，選用實驗室保存的芥菜自交系種子9號，由河南農業大學園藝學院蔬菜系提供。

1.2 方法

1.2.1 不同處理對芥菜下胚軸伸長的影響 挑選籽粒飽滿的種子用自來水沖洗，將消過毒的種子用鑷子均勻放入鋪有濾紙的廣口瓶中，用移液槍向廣口瓶中注入1 mL蒸餾水，每隔1 d注1次水，預培養3 d以促進種子的萌發。3 d后放入25 ℃組培室中培養，光處理條件下的光周期為16 h/8 h（白天/夜間），黑暗處理采用黑色布遮光。以蒸餾水處理作為對照（CK），分別采用0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mg·L-1 的2，4-表油菜素內酯（EBR，母液用無水乙醇配制）進行處理。為了研究不同激素處理對下胚軸伸長的影響，以蒸餾水處理作為對照（CK），2，4-表油菜素內酯（EBR，0.02 mg·L-1）、硝酸銀（AgNO3，5 ?mol·L-1）、乙烯利（Ethephon，100 ?L·L-1）、萘乙酸（NAA，0.5 mg·L-1）、萘乙酸+表油菜素內酯（NAA 0.5 mg·L-1+EBR 0.02 mg·L-1）、乙烯利+表油菜素內酯（Ethephon 100 ?L·L-1+EBR 0.02 mg·L-1）、硝酸銀+乙烯利（AgNO3 5 ?mol·L-1+Ethephon 100 ?L·L-1）分別進行處理，7 d后開始測量下胚軸長度。每個試驗重復3～5組，每組測定10～15株。

1.2.2 EBR處理對乙烯含量的影響 乙烯含量的測定參考Larsen and Cancel的方法，略有改動[15]。在芥菜種子出芽后10 d，分別采用0、0.1、1 mg·L-1的EBR處理幼苗24 h，每瓶選用生長勢一致的幼苗10株，重復3～5瓶。將選出的幼苗放入密閉的塑料瓶（330 mL）中，3～5 h后抽取容器內氣體1 mL，用GC-2010 plus氣相色譜進行測定。色譜條件設定如下：GDX-502填充柱，FID檢測器，氮氣流速為20 mL·min-1，溫度60 ℃。計算方法：乙烯生成量=c×V/m×t×1 000 （μL·kg-1·h-1），其中c代表樣品測定值（μL·L-1），V代表容器體積（mL），t代表測定時間（h），m代表樣品質量（kg）。

1.2.3 數據統計與分析 試驗數據采用Excel 2010軟件進行標準誤差的計算和作圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的EBR處理對芥菜幼苗下胚軸伸長的影響

由圖1可以看出，光處理下，不同濃度的EBR處理對芥菜幼苗下胚軸的伸長均有明顯的促進作用，下胚軸長度隨EBR濃度的升高呈現先上升后下降的變化趨勢，從0.001～0.05 mg·L-1逐漸增大，0.05 mg·L-1之后卻逐漸減小。其中0.05 mg·L-1的EBR處理對芥菜幼苗下胚軸伸長的影響最大，比對照增加了16.63%；暗處理中，與對照相比，EBR處理的芥菜幼苗下胚軸的伸長均受到抑制，下胚軸長度隨EBR濃度的升高呈現先下降后上升再下降的變化趨勢，0.2 mg·L-1的EBR處理的芥菜下胚軸最短。以上結果表明，光照在BR調控下胚軸的伸長過程中具有可逆反的作用，同時低濃度BR有明顯的促進作用，而高濃度的BR則有一定的抑制效果。

2.2 不同外源激素處理對芥菜下胚軸伸長的影響

由圖2可以看出，在光處理下，與對照相比較，Ethephon抑制了下胚軸的生長，而AgNO3部分抵消了Ethephon的抑制作用。EBR、NAA、EBR+NAA可以促進芥菜下胚軸的生長。在EBR+Ethephon和Ethephon+AgNO3組合處理中，乙烯均表現為抑制下胚軸的生長。

在暗處理中，對照處理的芥菜下胚軸最長，其次為EBR+NAA、EBR、AgNO3、NAA、EBR+Ethephon、Ethephon+AgNO3、Ethephon。同對照相比較，Ethephon、EBR和NAA均表現為抑制下胚軸生長，其中Ethephon的抑制作用較強，EBR和AgNO3均部分抵消了Ethephon的強烈抑制作用。

在所有的光處理和暗處理中，黑暗處理時下胚軸長度均高于光照處理的；EBR和NAA可協同促進下胚軸的伸長；在調控芥菜下胚軸的生長作用上，Ethephon具有明顯的抑制作用，而EBR具有明顯的促進作用，且EBR可以抵消Ethephon的抑制作用。

2.3 EBR處理后乙烯含量的變化

如圖3所示，當用0.1 mg·L-1的EBR處理芥菜時，乙烯含量比對照顯著增加，當用1 mg·L-1的EBR處理芥菜時，乙烯生成量比0.1 mg·L-1的EBR處理時顯著增加，這表明EBR可以促進芥菜幼苗乙烯的合成。但是乙烯生成量的上升與下胚軸的伸長并不成正相關，因此乙烯生成量并不是下胚軸伸長的關鍵因素。

3 討論與結論

油菜素內酯具有廣泛的生長發育調節功能，參與多種植物的生命活動過程。筆者研究發現，外源油菜素內酯在光照條件下可以促進芥菜下胚軸的伸長，但是濃度高于0.05 mg·L-1卻表現為抑制作用，這表明低濃度油菜素內酯具有促進作用而高濃度卻有一定的抑制作用。黑暗條件下，外源油菜素內酯抑制下胚軸的伸長，隨著處理濃度的升高，抑制效果略微下降，這表明可能存在高濃度促進的效果，本次試驗中采用的最高濃度為1 mg·L-1，更高濃度的效果有待于進一步研究。從本試驗結果分析，外源EBR施用濃度對于下胚軸的抑制或促進作用存在差異，同時與光照密切相關，這表明光照可能參與了芥菜下胚軸的生長調控作用。前人研究結果表明，植物幼苗的生長發育調控機制在有無光照條件下差別比較大，尤其是下胚軸的伸長、子葉節的彎曲、子葉和胚軸的著色等都與光信號密切相關[14，16]。

乙烯在黑暗條件下可以誘導產生“三重反應”，具有明顯的促使下胚軸變短的作用。本研究中，乙烯利處理無論在黑暗或光照條件下均表現為抑制下胚軸伸長，同時AgNO3可以抵消乙烯利的抑制作用。此外，EBR+Ethephon處理抵消了Ethephon處理中下胚軸被抑制的長度，這表明外源EBR和AgNO3可能具有相似的作用。 BR可以提高芥菜中乙烯的合成，這與前人的研究結果相似。例如王建華等[17]研究發現，BR促進葉片和葉柄乙烯的產生。油菜素甾醇類可以促進ACS5蛋白的穩定性，從而調控乙烯的生物合成[18]。但是EBR與Ethephon對芥菜下胚軸生長的作用卻截然相反，這表明乙烯和BR在調控芥菜下胚軸伸長的生理現象上存在著拮抗作用，同時乙烯的含量與下胚軸的伸長關系并不大。Liesbeth De Grauwe等[19]的研究指出，ETH信號途徑通過PIN調控生長素的轉運和分布，進而影響下胚軸的生長發育，而BR抑制PIN途徑。此外，BR可以通過FERONIA調控途徑拮抗乙烯誘導的下胚軸縮短作用[20]。結合本試驗的結果，芥菜下胚軸的伸長可能受到多種內源激素信號途徑的共同調控。本研究結果表明，芥菜下胚軸的伸長與光照和BR的濃度密切相關，同時它們可能與乙烯、生長素等信號途徑互作共同調控下胚軸的伸長。

參考文獻

[1] 沈進娟，冉廣葵，張紹榮，等.航天誘變對芥菜生理生化特性的影響[J].西南農業學報，2012，25（4）：1242-1247.

[2] KHAN M，ROZHON W，BIGEARD J，et al.Brassinosteroid regulated GSK 3/Shaggy-like kinases phosphorylate mitogen-activated protein（MAP） kinase kinases，which control stomata development in Arabidopsis thaliana[J].Journal of Biological Chemistry，2013，288（11）：7519-7527.

[3] HARTWIG T，CHUCK GS，FUJIOKA S，et al.Brassinosteroid contro1 of sex determination in maize[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（49）：19814-19819.

[4] 李雅潔，張其安，陸曉民.油菜素內酯對硝酸鈣脅迫下黃瓜幼苗抗氧化系統及可溶性蛋白表達的影響[J].安徽科技學院學報，2017，31（1）：35-40.

[5] 王舒甜，張金池，張亮.油菜素內酯對鹽脅迫下香樟葉片光合色素以及葉綠素熒光的影響[J].浙江大學學報（農業與生命科學版），2017，43（1）：45-53.

[6] 程彥偉，丁賀，韓建明，等.天然油菜素內酯對豆類種子發芽和胚根下胚軸伸長的影響[J].江蘇農業科學，2014，42（9）：140-142.

[7] 劉靈，李海航，楊麗霞，等.油菜素內酯促進綠豆下胚軸不定根發生研究[J].科技導報，2007，5（25）：227.

[8] 徐如涓，郭一松，劉毓橘.表油菜素內酯對黃瓜下胚軸伸長，內源GA3，ABA及淀粉含量的影響[J].植物生理學報，1990，16（2）：125-130.

[9] 李元元，曹清河.油菜素內酯參與調控植物生長發育與抗逆性的機制及其育種應用研究[J].中國農業科技導報，2015，17（2）：25-32.

[10] 李凱榮，韓剛.天然油菜素內酯促進檸條和紫穗槐種子發芽及下胚軸伸長效應[J].西北林學院學報，2003，18（4）：17-20.

[11] 程彥偉，丁賀，韓建明，等.天然油菜素內酯對豆類種子發芽和胚根下胚軸伸長的影響[J].江蘇農業科學，2014，42（9）：140-142.

[12] GUDESBLAT G E，RUSSINOVA E.Plants grow on brassinosteroids[J].Current Opinion in Plant Biology，2011，14（5）：530.

[13] ZHOU X Y，SONG L，XUE H W.Brassinosteroids regulate the differential growth of arabidopsis hypocotyls through auxin signaling components IAA19 and ARF7[J].Molecular Plant，2013，6（3）：887-904.

[14] KIM B，JEONG Y J，CORVALAN C，et al.Darkness and gulliver2/phyB mutation decrease the abundance of phosphorylated BZR1 to activate brassinosteroid signaling in Arabidopsis[J].The Plant Journal，2014，77（5）：737-747.

[15] LARSEN P B，CANCEL J D.Enhanced ethylene responsiveness in the Arabidopsis eer1 mutant results from a loss-of-function mutation in the protein phosphatase 2AA regulatory subunit，RCN1[J].The Plant Journal，2003，34（5）：709-718.

[16] MCNELLIS T W，DENG XW.Light control of seedling morphogenetic pattern[J].Plant Cell，1995，7（11）：1749-1761.

[17] 王建華，徐同.油菜素內酯對酸雨傷害的棉花子葉膜脂質過氧化和乙烯產生的影響[J].湖北農學院學報，1991，11（4）：1-6.

[18] HANSEN M，CHAE HS，KIEBER J J.Regulation of ACS protein stability by cytokinin and brassinosteroid[J].Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2009，57（4）：606-614.

[19] GRAUWE L D E ，VANDENBUSSCHE F，TIETZ O，et al.Auxin，ethylene and brassinosteroids：tripartite control of growth in the Arabidopsis thaliana hypocotyl[J].Plant & Cell Physiology，2005，46（6）：827-836.

[20] DESLAURIERS S D，LARSEN P B.FERONIA Is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in Arabidopsis hypocotyls[J]. Molecular Plant，2010，3（3）：626-640.