米糠黃酮的提取及其抗癌活性初步研究

劉劍利 劉 丹 王 帥 唐志鵬 賀 音 曹向宇

(遼寧大學生命科學院，沈陽 110036)

米糠是稻谷加工的副產品，約占稻谷產量5.0% ～5.5%，年產近 1 000萬 t，是一種產量大、綜合利用價值不高的農副產品［1］。在我國，米糠大部分用于畜禽飼料使用，有效成分利用率不足20%［2］。近年來，研究發現米糠中包含豐富的活性成分，包括低過敏性的米糠蛋白［3］;降低人體血清膽固醇的米糠油［4］;增強免疫力的米糠多糖［5］;米糠中含有15% ～23%脂肪、14% ～16%蛋白質、25% ～40%膳食纖維，還含有大量γ－谷維素(3.86～5.89 mg/g)、多酚(9.60 ～81.85 mg GAE/g)、維生素 E(0.32 ～0.44 mg/g)等生理活性物質［6］。研究表明:米糠中含有花青素、柚皮素和槲皮素等黃酮類化合物，具有較強的生物活性，如顯著的抗氧化、抗衰老等功能［7］，而關于米糠黃酮抗肺癌的研究鮮有報道。開發和利用米糠黃酮既有利于資源的循環利用，又能產生一定的經濟收益，為人類健康和疾病預防提供一種明確生物活性的天然物質。

黃酮類化合物比較常用的制備方法包括有機溶劑提取、堿性水提、超臨界萃取等，水浸提的弊端在于粗品中含有很多不純成分，得率偏低;堿提浸出效果好，但雜質多，給后期純化帶來不便;超臨界CO2萃取技術具有得率高、無殘留溶劑、無污染的優點，但是所需設備價格昂貴、生產成本高［8］。目前，米糠黃酮最常用的提取方法為有機溶劑提取，黃酮提取率不高［9］。因此尋求生產成本較低的、黃酮得率高的方法，對于黃酮開發具有重要意義。超聲波法利用超聲波動形式破壞組織，促進溶劑的穿透作用，提高有效成分的得率［10］。酶解法通過降解植物細胞壁，促進胞內有效成分溶出，較溫和的將組織分解，確保提取物的性質穩定，既能縮短所用時間，又能提高得率［11］。本研究擬采用響應面法優化超聲輔助酶法提取米糠黃酮工藝，進一步研究米糠黃酮對人肺癌細胞(A549)的作用，以期為米糠資源的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，沈星1號:沈陽市北星水稻研究所;人非小細胞肺癌細胞A549:中國醫科大學，實驗室液氮保存;蘆丁(純度﹥95%)、纖維素酶(酶活力U/g≥1.5×104)、二甲基亞砜(DMSO):國藥集團化學試劑有限公司;3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽(MTT):Sigma公司;RPMI－1640培養基(Hyclone)、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶:北京鼎國生物技術有限責任公司;Hochest33258:南京凱基生物科技。

1.2 主要儀器設備

UV－2700紫外分光光度計:島津企業管理(中國)有限公司;SCIENTZ－IID超聲波細胞粉碎機:寧波新芝生物科技股份有限公司;SCIENTZ－10N型真空冷凍干燥機:寧波新芝生物科技股份有限公司;RE－52CS－2型旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器廠;Multiskan FC型酶標儀:賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;HERACELL 150i二氧化碳培養箱:北京昊諾斯科技有限公司;Nikon(MODEL C－SHG1)熒光顯微鏡:尼康儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮得率的測定

參照關海寧等［12］方法，制作蘆丁標準曲線。根據標準曲線，計算出提取液中黃酮的質量濃度，通過公式得出米糠黃酮得率。

式中:C為標準曲線計算出測定樣液的質量濃度/mg/mL;V為測定吸光度時樣液的體積/mL;N為提取液總體積/測定吸光度移取樣液的體積;M為米糠質量/mg。

1.3.2 單因素實驗

米糠經粉粹機粉碎，過60目篩制成粉末備用。稱取1 g米糠粉末，置于小燒杯中，固定其他實驗條件(蒸餾水20 mL，水浴溫度50℃，酶解時間2 h，pH 5)，進行酶解反應，酶解結束后，離心取上清，余下沉淀進行超聲處理，超聲后離心取上清，合并上清液測得率。以米糠黃酮的得率為指標，分別考察超聲輔助酶法提取米糠黃酮的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、加酶量(60、90、120、150、180 U/g)、乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)、超聲時間(10、20、30、40、50 min)4 個因素對米糠黃酮得率的影響，每組實驗做3個平行。

1.3.3 Box－Behnken實驗設計

以米糠黃酮得率為響應值，根據單因素實驗結果，選擇對米糠黃酮影響顯著的4個因素，采取4因素3水平的組合設計，篩選制備米糠黃酮的最佳工藝條件。

表1 Box－Benhnken實驗設計水平

1.3.4 米糠黃酮抗肺癌活性的測定

細胞培養條件:A549細胞系常規培養于RPMI 1640培養液中，內含10%胎牛血清，1%雙抗(青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL)，待細胞生長密度達到80% ～90% 時，按照1∶3比例傳代，37℃、5%CO2培養箱培養至細胞處于對數生長期即可用于實驗。實驗中米糠黃酮提取液經冷凍干燥后得到粉末，采用A549細胞的培養基將其溶解，細胞處理所用黃酮液的添加量為總體積的4.76%，未對細胞培養體系形成實質性改變。

1.3.4.1 米糠黃酮對A549細胞損傷的形態學觀察

A549細胞以每孔4×105個接種到6孔板內，每孔培養液體積2 mL，置于37℃ 5%的CO2培養箱中培養24 h，然后設置正常對照組、實驗組(米糠黃酮質量濃度 20、40、80 mg/mL)，共同培養 24 h，在顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.4.2 米糠黃酮對A549細胞增殖情況影響

A549細胞以每孔3×103個接種到96孔板內，每孔培養液體積200μL，細胞培養方法及各劑量組濃度同 1.3.4.1，MTT 法檢測細胞活力。

1.3.4.3 米糠黃酮對A549細胞凋亡水平影響

處理好的蓋玻片置于12孔板中，將A549細胞以每孔8×104個接種到12孔板內，每孔培養液體積1 mL，細胞培養方法及各劑量組濃度同 1.3.4.1，24 h后去除培養基，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min后，去固定液并清洗，向蓋玻片上滴加100μL Hoechst33258工作液，染色后于熒光顯微鏡下觀察，計算凋亡率。

1.4 數據分析

實驗重復3次，結果取平均值，數據采用SPSS 20.0進行方差分析，比較組間差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

如圖1所示，黃酮含量與其在510 nm處的吸光度值呈良好的相關性，其中R2=0.999 2，根據公式y=10.97x+0.058 2可計算出提取液中黃酮含量。

2.2 單因素實驗結果

根據圖2可知，料液比在1∶10～1∶20 g/mL的范圍內，米糠黃酮的得率呈現不斷上升趨勢，當料液比為1∶20 g/mL時，米糠黃酮得率最高，當料液比比值持續變大時，米糠黃酮的得率逐漸減小。這可能是因為液料比為1∶20 g/mL時，黃酮類物質已基本溶出，繼續增加溶劑用量反而會促使其他雜質的溶出，使得黃酮得率下降［13］?？紤]到節約成本以及后續回收操作，因此選擇1∶20為最佳料液比。加酶量在60～180 U/g的區間內，米糠黃酮的得率呈現先上升后平緩趨勢，在120 U/g時，得率最高;繼續增大加酶量，黃酮得率變化不大。原因是加酶量不足導致細胞壁沒有充分溶解，細胞內含物質釋放不完全，導致得率低。當加酶量足夠時，細胞壁被充分降解，黃酮從細胞中被釋放出來，提高得率。但當加酶量繼續增大時，米糠黃酮的得率沒有繼續上升，原因可能是溶液中的酶添加量已接近飽和，繼續增加酶用量，對得率作用不大。從降低成本、節約能源角度考慮，加酶量為120 U/g時最佳。

圖1 蘆丁標準曲線

2.3 響應面實驗結果

圖2 不同因素對米糠黃酮得率的影響

如圖2所示，一定范圍內，當乙醇體積分數持續提高，米糠黃酮的得率呈現上升趨勢，在乙醇體積分數為60%時，得率最高。隨著乙醇體積分數由60%不斷加大到80%，米糠黃酮的得率不斷減小。這是由于乙醇體積分數變大，會增加其他醇溶性物質的溶出量，使黃酮類物質的得率呈現下降趨勢［13］。綜合來看，乙醇體積分數控制在60%左右為宜。超聲時間在10～20 min的范圍內，米糠黃酮的得率逐漸提高，在超聲時間到達20 min時，米糠黃酮得率最高。但當超聲時間繼續提高，米糠黃酮的得率呈現減小趨勢?？赡苁怯捎诔曔^程中機械效應和熱效應不斷上升，對黃酮類物質產生破壞。由此可知20 min為最佳超聲時間。

采用 Design－Expert 7.0軟件中的 Box－Behnken程序進行實驗設計。結果見表2，根據表2數據進行分析得出以米糠黃酮得率為響應值的回歸方程為:

表2 Box－Benhnken實驗設計結果

2.4 回歸模型方差分析

由表3 可知，一次項 A、B、C、D 和二次項 A2、B2、C2、D2對米糠黃酮得率的作用均達到了極顯著水平;模型(P＜0.000 1)極顯著，失擬項(P=0.054 8＞0.05)不顯著，說明模型成立。方程相關系數R2=0.969 7，校準決定系數 R2Adj=0.939 4，變異系數CV%=1.2，說明模型與實際擬合程度好，能較好地反映米糠黃酮得率與各因素之間的關系，由影響因素的F值可以判斷各因素對得率的影響順序為:B＞A＞C＞D。

表3 響應面實驗回歸模型方差分析

2.5 雙因素交互作用分析

通過Box－Behnken實驗得出各實驗因子對米糠黃酮得率變化的交互作用，確定各因素的最優影響范圍。料液比在1∶18～20 g/mL范圍，酶用量在120～126 U/g范圍，乙醇體積分數在59% ～61%之間，最適的超聲時間在18～20 min之間對黃酮得率最佳。其中，影響米糠黃酮得率最顯著的因素為加酶量，其他因素次之，各項單因素對應的P值均小于0.01，皆達到極顯著水平。

2.6 驗證實驗結果

利用Design－Expert 7.0軟件得到預測的米糠黃酮最佳提取工藝為:料液比1∶18.82 g/mL、酶用量124.69 U/g、乙醇體積分數 60.49%、超聲時間 18.97 min，在此條件下黃酮的理論得率為0.524%?？紤]到實際操作中遇到問題，將此工藝修整為:料液比1∶19 g/mL、酶活力125 U/g、乙醇體積分數 60%、超聲時間19 min，并進行3次驗證實驗，得出黃酮得率為0.52%，與預測值基本吻合，說明模型能較好預測米糠中黃酮得率，優化工藝條件較可靠。

2.7 米糠黃酮對人肺癌細胞損傷的形態學觀察結果

從圖3可以看出，對照組細胞形狀勻稱，貼壁較好，棱角清晰。隨著米糠黃酮濃度的增加，細胞貼壁數目逐漸減少，邊緣模糊，折光性減弱，其中80 mg/mL米糠黃酮組細胞明顯變圓收縮，凋亡特征明顯，說明米糠黃酮對肺癌A549細胞具有抑制作用，并且呈現量效關系。劉盛楠等［14］選取白藜蘆醇誘導肺癌A549細胞，細胞形態與本實驗的結果。

圖3 米糠黃酮對A549貼壁細胞數的影響(100×)

2.8 米糠黃酮對人肺癌細胞增值情況的影響

由圖4所示，米糠黃酮能夠有效抑制A549細胞的生長，并且隨米糠黃酮劑量的升高，對細胞抑制效果增強。當質量濃度上升到80 mg/mL時，細胞存活率變為(42.6±0.13)%，與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，對A549細胞的生長抑制作用明顯。李富華等［15］實驗表明苦蕎麩皮黃酮在實驗質量濃度范圍內，能顯著抑制HepG2細胞增殖且表現出量效關系，與米糠黃酮效果類似。

圖4 米糠黃酮對A549細胞增殖的影響

2.9 米糠黃酮對A549細胞的Hoechst33258實驗結果

Hoechst33258是一種熒光藍色染料，用于細胞凋亡檢測。本實驗通過Hoechst33258染料檢測不同濃度的米糠黃酮誘導A549細胞凋亡的能力。對照組細胞顯現均勻且較弱的藍色熒光，與對照組相比，當米糠黃酮處理組濃度提高時，細胞核皺縮的數量上升，出現明亮的藍色熒光斑塊，即凋亡細胞數量上升，與對照組比較，差異極顯著;而且隨著米糠黃酮處理濃度的升高，細胞的數量逐漸減少，與對照組比較，差異極顯著(P＜0.01)。結果表明，米糠黃酮可以有效的誘導人肺癌A549細胞的凋亡。鐘良瑞等［16］實驗證明經三葉青黃酮處理的A549細胞通過Hoechst 33258染色后細胞出現形態學改變，凋亡細胞的細胞核顏色變亮，出現增強的藍色熒光，與米糠黃酮效果相近。

圖5 熒光顯微鏡下觀察A549細胞Hoechst33258實驗結果(200×)

3 結論

通過單因素和響應面實驗對影響米糠黃酮制備的4個因素進行探究，得出提取的最佳工藝條件為:料液比1∶19 g/mL、加酶量125 U/g、乙醇體積分數60%、超聲時間19 min，得出米糠黃酮得率為0.52%。通過細胞形態學觀察、MTT細胞活力檢測及Hoechst33258細胞凋亡實驗均顯示米糠黃酮對A549細胞具有一定的生長抑制作用，說明制備的米糠黃酮具有一定抗癌活性，但其機制還有待進一步研究。