不同ELISA試劑盒與PCR法檢測雞新城疫病毒的比對試驗與研究*

孟凱 ，邵明辰 ，袁小遠 ，張玉霞 ，王友令 **

（1.山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250100；2.山東魯南牧工商有限公司，山東 滕州 277500）

雞新城疫（Newcastl Disease，ND）是禽類的一種急性、高度接觸性及致死性烈性傳染病，是當今世界范圍內最嚴重的家禽傳染病之一。亞洲是本病的重災區，因此本病又稱為亞洲雞瘟，可造成大面積的流行，本病的大面積流行與候鳥的遷徙是密不可分的，由于人類無法控制這種候鳥的遷徙行為，因此本病能跨區域跨國傳播，每年造成的經濟損失非常巨大[1-2]。

由于在臨床上多見于送檢新城疫的死雞，而抗體檢測不適用于死雞，因此需要對病料進行新城疫病毒的檢測。在新城疫病毒的檢測中，常用方法有PCR、熒光定量PCR、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和免疫金標試紙條等[3-6]。由于ELISA具有快速、準確、簡便的優點，加之ELISA具有可批量檢測及自動化檢測的優勢，其更適合于大規模檢測和便于標準化，ELISA技術已越來越被廣大實驗室所采用。本研究中，我們選取了A、B、C三家公司的商品化ELISA新城疫病毒檢測試劑盒對50份臨床疑似新城疫病料進行檢測，分析了不同公司生產的ELISA試劑盒檢測結果與PCR法檢測結果的相關性，比較了A、B、C三家公司生產的ELISA試劑盒檢測結果的陽性符合率、陰性符合率、陰陽性總體符合率、試劑盒價格以及試驗時長等數據，以期篩選出既準確實用、操作簡便，又能最大程度節約檢測成本的適用于臨床大規模雞場新城疫病毒檢測的ELISA試劑盒。

1 材料與方法

1.1 試劑材料 雞新城疫病毒La Sota疫苗株購自中國獸藥監察所；50份臨床疑似新城疫病料均來自濰坊市寒亭區某一發病雞場；雞新城疫病毒ELISA檢測試劑盒分別購自A、B、C三家生物科技有限公司，其中A公司生產的雞新城疫病毒ELISA檢測試劑盒為國外進口產品，B公司和C公司生產的雞新城疫病毒ELISA檢測試劑盒為國產產品；病毒RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；AMV反轉錄酶、dNTP為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR檢測 根據GenBank已發表的雞新城疫病毒F基因的保守核苷酸序列，應用DNA Star軟件和Primer 6.0生物軟件設計一對特異性引物。其中F：5'-TGCACGATTCAATGACCGGA-3' ；R：5'-GTGCAGACCAAATCCTCCGA-3' ；目的條帶大小為200bp。引物由華大基因公司合成，儲存液濃度為50pmol/μl，置于-20℃保存備用。參照病毒RNA提取試劑盒說明書進行病毒RNA提取，參照AMV反轉錄試劑盒說明書制備cDNA。PCR 反 應 體 系 如 下 ：94℃ 5min；94℃ 30s，53℃30s，72℃ 1min，35 個循環；72℃ 10min。 陽性對照為新城疫病毒La Sota疫苗株，陰性對照為SPF雞胚尿囊液。反應產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。觀察結果并記錄。

1.2.2 ELISA檢測 其操作方法分別依照A、B、C三家公司的新城疫病毒ELISA檢測試劑盒說明書進行。

1.3 ELISA方法和PCR方法的檢測符合率分析 以PCR為基礎，PCR檢測結果為陽性的樣本用ELISA方法得出的陽性率便為二者的陽性符合率，PCR檢測結果為陰性的樣本用ELISA方法得出的陰性率便為二者的陰性符合率，用兩種方法檢測同為陽性或陰性的樣本占檢測總樣本的比率為二者的總體符合率。

1.4 待檢樣品的檢測 采用A、B、C三家公司的禽新城疫病毒ELISA檢測試劑盒分別對50份臨床樣品（其中34份為PCR檢測陽性，16份為PCR檢測陰性）進行檢測，利用統計學方法對檢測結果進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 ELISA方法對50份臨床樣品的檢測結果 按照新城疫病毒ELISA檢測試劑盒提供的臨界點判定值，采用 A、B、C三家公司的禽新城疫病毒ELISA檢測試劑盒分別對50份臨床樣品進行檢測，結果見表 1、表 2、表 3。

表1 A公司ELISA檢測試劑盒對臨床樣品的檢測結果

表2 B公司ELISA檢測試劑盒對臨床樣品的檢測結果

表3 C公司ELISA檢測試劑盒對臨床樣品的檢測結果

由表1、表2、表3可以看出，A公司生產的ELISA試劑盒與PCR方法的陽性符合率達到了94.1%，陰性符合率為87.5%，陰陽性總體符合率為92%；B公司生產的ELISA試劑盒與PCR方法的陽性符合率為91.2%，陰性符合率為93.8%，陰陽性總體符合率為92%；C公司生產的ELISA試劑盒與PCR方法的陽性符合率為85.3%，陰性符合率為81.3%，陰陽性總體符合率為84%。

2.2 三家公司新城疫病毒ELISA檢測試劑盒的價格及平均試驗時長 A、B、C三家公司的新城疫病毒ELISA檢測試劑盒價格及試驗時長如表4所示。

表4 ELISA檢測試劑盒價格及試驗時長

3 討論

目前，在臨床上已經有多種試驗方法用于雞新城疫病毒的檢測，其中最為常見的為ELISA和PCR試驗方法，對于養雞場和養殖戶來說，掌握一種適合自己的檢測方法就可以節約雞新城疫病毒檢測的成本，并能夠實時監測雞群健康狀況，在臨床上對雞新城疫疾病的防控起到很好的預防效果。

結合本試驗所得出的數據，可以看出A公司生產的雞新城疫病毒ELISA檢測試劑盒與PCR方法的陽性符合率最高，達到了94.1%；陰性符合率為93.8%，陰陽性總體符合率為92%，平均試驗時長為2.5h，試驗時間大大縮短，其產品性能在三家公司中最好，但其試劑盒的價格為1800元，遠遠高于其他兩家公司的產品，考慮到成本問題，A公司生產的ELISA試劑盒不適于在臨床上大規模的推廣；其次是B公司生產的新城疫病毒ELISA檢測試劑盒，該試劑盒的檢測結果與PCR方法的檢測結果的陽性符合率為91.2%，陰性符合率為87.5%，陰陽性總體符合率為92%，產品性能稍低于A公司產品，雖然試驗時間較A公司產品略長，但其價格為1300元，價格優勢明顯；C公司生產的試劑盒的價格雖然最低，但其與PCR方法的陽性符合率僅為85.3%，陰性符合率為81.3%，陰陽性總體符合率僅為84%，其產品性能均與A、B兩家公司的產品存在差距，因此也不適于臨床上的推廣應用。

本試驗中，通過比較A、B、C三家公司生產的雞新城疫病毒ELISA檢測試劑盒的性能、價格及試驗時長等數據，可以看出，B公司生產的ELISA檢測試劑盒價格優勢明顯且產品性能完全能夠滿足臨床需要，適于臨床樣本的大規模檢測。