賀蘭山東麓不同陳釀年份赤霞珠干紅葡萄酒中酚類物質對澀感質量的影響

李輝，張靜，李超，孟哲，周艷芬，張軍翔,2*

1(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川，750021) 2(寧夏大學 葡萄酒學院，寧夏 銀川，750021)3(寧夏大學 化學化工學院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，寧夏 銀川，750021)4(賀蘭晴雪酒莊，寧夏 銀川，100020)

葡萄酒的陳釀可以修飾葡萄酒的感官特性，使葡萄酒的品質得到提升。瓶內陳釀是葡萄酒陳釀環節的一部分，在瓶儲過程中葡萄酒會發生一系列反應，包括增加葡萄酒顏色的穩定性、澄清度以及形成更加復雜的酚類物質[1]。在瓶儲期間葡萄酒的感官品質也會得到提升，比如會增加一些獨特的香氣[2-3]，口感會更加的圓潤，同時橡木味和澀感的強度會降低。酚類物質是葡萄酒中的重要成分，對葡萄酒的感官特性比如顏色、澀感、苦味還有香氣都有直接或者間接的影響[4-6]。而在儲藏期間，許多因素比如溫度、光照、瓶子擺放位置、氧氣含量、陳釀時間長短等都會影響酚類物質的成分[7]。因此大部分酚類成分不穩定并且在陳釀期間會發生一系列化學反應，尤其是氧化和聚合反應。單寧是葡萄酒中非常重要的酚類物質，對葡萄酒的穩定性和感官質量都有著重要作用。比如單寧和花色苷直接結合或者通過乙醛橋連接形成穩定的單寧—花色素復合物從而使葡萄酒的顏色更加穩定。優質干紅葡萄酒中的優質單寧帶來的澀感可以使葡萄酒的口感更加的圓潤有結構感，目前國內對于葡萄酒澀感的評價大部分都是葡萄酒的單一澀感強度，但這并不能說明澀感質量的好壞，GAWEL[8]就將澀感描述為天鵝絨般的(velvet)、干燥的(drying)、皺褶的(pucker)等，本實驗通過品評小組對葡萄酒的干澀和絨澀進行了評價，從而對赤霞珠干紅葡萄酒中酚類物質澀感質量的好壞進行更細致的研究。有許多文章對短期陳釀過程中葡萄酒的酚類物質[9-10]、顏色[11]、香氣[12]進行了報道，但對于葡萄酒長時間陳釀過程中酚類物質及澀感的變化報道卻很少，本文對來自同一酒莊，相同釀造工藝，同一瓶儲環境，2005—2006年和2008—2015年10個不同陳釀年份的赤霞珠干紅葡萄酒的總酚、總單寧、總花色苷、兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、原花青素B1、B2和(表)兒茶素三聚體、澀感質量進行了量化分析，統計分析澀感質量與多酚成分之間的相關性，以期對葡萄酒的陳釀技術提供一些理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：實驗選用寧夏賀蘭山東麓賀蘭晴雪酒莊10個年份的赤霞珠干紅葡萄酒，分別是2005、2006年份、2008—2015年份。所有的葡萄酒均是陳釀型葡萄酒，在橡木桶陳釀12個月后裝瓶，并在相同酒窖進行陳釀(溫度12～18 ℃，相對濕度60%～80%)。

試劑：兒茶素(+)-catechin(C)、表兒茶素(-)-epicatechin (EC)、表棓兒茶素(-)-epigallocatechin (EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(-)-epicatechin-3-O-gallate (ECG)(純度>98%)，上海源葉生物科技有限公司；原花青素B1[(-)-epicatechin-(4β-8)-(+)-catechin]、原花青素B2[(-)-epicatechin-(4β-8)-(-)-epicatechin]、干沒食子酸(純度>98%)，美國Sigma公司；甲醇、甲酸(色譜級)，美國Fisher；Na2CO3、Folin-Ciocalteu試劑、濃鹽酸、無水乙醇、硫酸奎寧、Al2(SO4)3、酒石酸、氨水(分析純)均為國產。

1.2 儀器與設備

Dionex Ultimate 3000 UHPLC 超高效液相色譜儀、配有ESI離子源的LTQ-XL增強型線性離子阱質譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Syncronis-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，美國Thermo Fisher Scientific公司；KH-250DB型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器公司生產；實驗用水為Milli-Q純水系統，美國 Millipore公司制備；TGL-16M高速冷凍離心機，湖南湘儀；旋渦混合器QL-866，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣常規理化指標測定

酒精、pH值、總酸、干浸出物的測定參照國標GB/T 15038—2006

1.3.2 總酚含量測定

Folin-Ciocalteu法[13]

1.3.3 總單寧的測定[14]

先將葡萄酒樣品用蒸餾水稀釋50倍，取2支具塞試管，分別加入2.0 mL稀釋后酒樣，1.0 mL蒸餾水，6.0 mL濃鹽酸。試管1蓋上塞子密閉，用錫箔紙包嚴防光，沸水浴加熱30 min，迅速冷卻；試管2在常溫下放置30 min。隨后在2支試管中加入1.0 mL無水乙醇，在550 nm下測定試管1吸光值A1、試管2吸光值A2，單寧質量濃度(g/L)計算見公式(1)。

ρ(單寧)=(A1-A2)×19.33

(1)

1.3.4 兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯及原花青素B1、B2含量測定

取2.0 mL葡萄酒，放入10.0 mL離心管中，置于高速冷凍離心機中，溫度設置為8 ℃，12 000 r/min離心20 min，吸取上清液0.1 mL用氨水調節pH至7.0，最后用20%甲醇定容到1.0 mL，漩渦混勻1 min，收集混合液至自動進樣瓶，待UHPLC-ESI-MSn分析。

UHPLC色譜條件：采用Syncronis-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相 A為體積分數為0.1%甲酸的水溶液，B為甲醇。梯度洗脫：0～15 min，B相體積分數為2%～20%；15～30 min，B相體積分數為20%～40%；30～40 min，B相體積分數為40%～90%；90%B保持5 min；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

質譜條件：負離子采集模式；毛細管電壓 3 kV；ESI源毛細管溫度320 ℃；輔助氣流速10 arb unit，吹掃氣流速30 arb unit；多級掃描碰撞氣(99.999 9%高純氦氣)；全掃描模式的質量掃描范圍m/z50～1 500；定性分析采用全掃描模式，其采集范圍m/z100～1 000；定量分析采用選擇離子掃描模式。

1.3.5 澀感質量感官分析[15-16]

感官評價小組由9位有葡萄酒感官評價經驗的專家組成，為了保證評價標準的一致性在感官分析前先進行感官品評培訓，分別利用3.0 g/L單寧、0.1 g/L 奎寧和4.0 g/L酒石酸溶液來辨別澀感與苦味和酸味之間的區別。澀感感官分析在標準的葡萄酒感官實驗室進行，常溫20 ℃，濕度70%。倒入30.0 mL對應干紅葡萄酒酒樣，要求品評員喝入口腔內酒樣能蓋住舌面，輕輕攪動舌頭，3～5 s后，輕吸一口氣，保持3 s后吐出酒樣。要求品嘗員選擇2個澀感術語(干澀:口腔內干燥的感覺；絨澀:口腔內柔順絲滑的感覺。)描述葡萄酒樣品的澀感。采用5點標度法打分：1分為隱約感覺到，強度最弱；2分為能感覺到，但不強；3分為能清晰地感覺到，中等強度；4分為明顯感覺，強度較大；5分為第一印象的感覺，強度最強。2個澀感術語可以多選，最終某一澀感特征的感官量化值MF采用(2)式計算。每品嘗過一個酒樣用去離子水清潔口腔2次，并咀嚼蘇打餅干使味覺得到恢復，且在對下一酒樣進行評價前至少等待30 s。每個酒樣的評價在5 min內完成。

(2)

式中：MF為感官量化值；F為該特征在品評組中的使用頻率，%；I為該特征平均得分在5分制中的強度率，%。

1.4 數據分析

運用SPSS 22.0進行方差分析用于分析不同陳釀年份葡萄酒之間主要理化指標的差異顯著性，通過相關分析發掘各主要理化指標和澀感評價相互之間的聯系。

2 結果與分析

2.1 常規理化指標分析

表1給出了不同年份葡萄酒酒精度、總酸和pH常規理化指標?？梢钥闯鏊x酒樣酒精度范圍在12.5%～15.2%之間，總酸范圍為5.0～7.4 g/L，pH范圍為3.4～3.7之間。部分年份葡萄酒之間的酒精度、總酸和pH值差異較大。這些差異可能與氣候因素有關，也可能與葡萄酒存放過程中酒精的揮發及酒石酸的沉淀有關。另外這些差異可能會對葡萄酒的澀感產生一定的影響。

表1 常規理化指標Table 1 Conventional physical and chemical indicators

注:表中數據表示平均數±標準偏差，同一列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。

2.2 酚類物質分析

表2給出了不同陳釀年份葡萄酒的總酚、總單寧、總花色苷含量。從表2可以看出，2011-2015年5個年份葡萄酒的總酚和總單寧的含量均顯著(p<0.05)地高于2005、2006和2010三個年份，隨著陳釀年份的增加，總酚和總單寧的含量總體上呈現出下降的趨勢。隨著陳釀年份的增加總花色苷含量總體上呈現出逐漸降低的變化趨勢，由表2可以看到2015年葡萄酒中的總花色苷含量是2005年的十幾倍，有報道在橡木桶或瓶內陳釀的最初幾年花色苷的含量會急速下降[17]。

表2 總酚總單寧及總花色苷含量Table 2 Total phenolic total tannin and totalAnthocyanidins content

在負離子模式下分別提取6種目標物的離子如圖1所示。從圖1可以看出兒茶素(C)與表棓兒茶素(EGC)較難分離，因此利用紫外檢測器高效液相色譜法難以對它們進行定性定量分析，但通過質譜提取離子的方法可以很好的將他們分開并進行定性定量分析。其他4種目標物在通過C18色譜柱后均得到了有效地分離，峰形比較窄，能夠很好地進行定性定量分析。

1-兒茶素C；2-表兒茶素EC；3-表棓兒茶素EGC；4-表兒茶素沒食子酸酯ECG；5-原花青素B1；6-原花青素B2，圖1 六種標品負離子模式提取離子質譜圖Fig.1 Six standard goods anion mode extraction of ionsspectrum

利用優化的前處理方法及UHPLC-ESI-MSn方法測定了10種不同年份的赤霞珠干紅葡萄酒中兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、原花青素B1、B2的含量(表3)。根據二級質譜圖(圖2)并參考文獻[18-20]推測在負離子模式下分子離子[M-H]-865m/z失去126(即1個間苯三酚)形成碎片離子m/z739；碎片離子m/z713則是由分子離子[M-H]-865m/z失掉152產生的；分子離子[M-H]-865m/z發生裂解失去290[即1個(表)兒茶素]得到m/z575，碎片離子m/z575進一步失去288[即失去2個氫原子的(表)兒茶素]得到碎片離子m/z287，綜上所述推斷分子離子[M-H]-865m/z是由3個(表)兒茶素構成的三聚體即(表)兒茶素-(表)兒茶素-(表)兒茶素三聚體，為了方便描述記作Trimer，另外為了方便分析將其含量以兒茶素計，結果如表3。

圖2 m/z 865離子的二級質譜圖Fig.2 MS2 spectrum of ion at m/z 865

由表3可以看出隨著陳釀時間的增加，兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表棓兒茶素(EGC)、原花青素B1、B2、(表)兒茶素三聚體(Trimer)的含量總體呈現逐漸下降的趨勢。在本實驗檢測的10個葡萄酒樣品中未檢測到表兒茶素沒食子酸酯(ECG)。從表3可以看出在黃烷-3-醇低聚體當中二聚體含量最高，通常在葡萄中的黃烷-3-醇寡聚體當中以二聚體最多[21]，其中原花青素B2是葡萄籽的主要成分[22]，而原花青素B1則主要存在于葡萄果皮中。

2.3 葡萄酒澀感質量分析

五點標度打分的結果通過公式計算得出干澀和絨澀的感官量化值分別用MF(干澀)、MF(絨澀)表示。從圖3雷達圖可以看到總體上陳釀時間較長的赤霞珠干紅葡萄酒比陳釀時間較短的MF(干澀)值較低，而MF(絨澀)值較高。另外從雷達圖上可以看到干澀突出的年份其絨澀則會比較低，其中最明顯的是2008年赤霞珠干紅葡萄酒。

表3 黃烷-3-醇單體、原花青素B1、B2及(表)兒茶素三聚體含量 單位：mg/L

注：“-”表示未檢測到

圖3 葡萄酒澀感質量感官評價雷達圖Fig.3 Astringency quality evaluation radar chart of wines

2.4 主要理化指標及澀感質量相關性分析

對相關理化指標及澀感評價進行相關分析結果如表4所示，從表4可以看總酚和總單寧的含量極顯著正相關(p<0.01)；干澀與絨澀極顯著負相關，說明在葡萄酒陳釀過程中絨澀的上升伴隨著干澀的下降。葡萄酒的干澀與總酚及總單寧的含量正相關，絨澀與總酚及總單寧的含量負相關，但并沒有顯著的相關性(p>0.05)，說明在葡萄酒陳釀過程中總酚及總單寧的含量變化并不是引起葡萄酒澀感質量變化的主要因素。兒茶素C、表兒茶素EC、表棓兒茶素EGC及原花青素B1、B2與干澀強度顯著正相關(p<0.05)；Trimer與干澀極顯著正相關。兒茶素C、表兒茶素EC、表棓兒茶素EGC、原花青素B1、B2、Trimer之間極顯著正相關?？偡优cTrimer顯著正相關，總單寧與原花青素B1、B2、Trimer顯著正相關。

表4 理化指標及澀感質量相關矩陣Table 4 Correlation analysis of physical and chemical indexes and astringency evaluation

注：**在 0. 01 水平( 雙側) 上顯著相關; * 在 0. 05 水平( 雙側) 上顯著相關

3 討論

葡萄酒的澀感會受到pH值、總酸、酒精度等多種因素的影響，有研究通過模擬酒樣[23]證明pH值在3.5和4.0之間(紅酒pH)變化對澀味沒有顯著影響；另外，在恒定pH值下酒石酸濃度(2～6 g/L)的變化對收斂無影響；但是在同一研究中，當提高乙醇水平時(8%、11%和14%)，澀感強度會降低，雖然乙醇有助于柔化多酚澀味[24]，但對澀感的影響較小[25]。本研究分析了10個不同陳釀年份系列赤霞珠干紅葡萄酒的總酚、總單寧、總花色苷及兒茶素C、表兒茶素EC、表棓兒茶素EGC、表兒茶素沒食子酸酯ECG、原花青素B1、B2和(表)兒茶素三聚體(Trimer)的含量并進行了感官分析。結果表明隨著陳釀年份的增加總酚、總單寧及總花色苷的含量呈逐漸降低的趨勢，這與CHIRA[26]的研究結果一致。相關性分析結果表明葡萄酒的干澀及絨澀與總酚、總單寧的含量并沒有顯著的相關性，干澀與兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素及原花青素B1、B2顯著正相關(p<0.05)，(表)兒茶素三聚體(Trimer)與干澀極顯著正相關(p<0.01)。PELEG[27]系統的研究了黃烷-3-醇單體、二聚體、三聚體的苦味及澀味，發現從單體到三聚體隨著聚合度的增加其澀味逐漸增強。本研究也說明了在葡萄酒陳釀過程總酚和總單寧含量的變化并不是引起澀感質量變化的主要因素，最主要的因素還是酚類物質結構的差異[26, 28-29]；兒茶素C、表兒茶素EC、表棓兒茶素EGC、原花青素B1、B2、Trimer之間極顯著正相關(p<0.01)，這在一定程度上說明這些物質的關系極為緊密，親核的黃烷-3-醇和親電的黃烷-3,4-二醇，通過C4—C8或C4—C6共價鍵連接可以形成寡聚物或者多聚物[18]。干澀與絨澀極顯著負相關，研究中并沒有發現與絨澀顯著相關的理化指標，可能是因為絨澀主要與聚合度高的單寧有關，但聚合度大于5的單寧就難以分離所以本實驗并沒有發現與絨澀顯著相關的單寧，如何對聚合度更高的單寧進行有效的分離還需要進一步的研究。

4 結論

對寧夏賀蘭山東麓10個不同年份赤霞珠干紅葡萄酒的酚類物質及感官評價分析結果表明，赤霞珠干紅葡萄酒在陳釀過程中總酚、總單寧、總花色苷的含量會降低，小分子酚類物質的含量也會減少。在赤霞珠干紅葡萄酒陳釀過程中干澀降低，絨澀增加。干澀和絨澀與總酚及總單寧的含量沒有顯著的相關性。葡萄酒的干澀與兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素及原花青素B1、B2顯著正相關，(表)兒茶素三聚體(Trimer)與干澀極顯著正相關，但并沒有發現與絨澀顯著相關的理化指標。