兩株lager啤酒酵母在傳代及自溶過程中生理性能差異的比較

丁華建，段鴻緒，王金晶，李崎，李永仙，鄭飛云，劉春鳳，鈕成拓

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

啤酒酵母作為啤酒釀造的重要原料之一，是影響啤酒品質的主要因素，對啤酒質量起決定性的作用[1-2]。在工業化啤酒釀造過程中，為降低經濟成本，酵母細胞會被多次重復使用，這種操作過程被稱為傳代(serial re-pitching)[1, 3]。在傳代過程中，酵母細胞在發酵結束時被收集并用于新一代的接種，而酵母細胞用于連續發酵的次數，叫做“代數”。啤酒釀造工業中，活躍的、年輕的和生理穩定的酵母細胞是生產高質量啤酒必不可少的，一些啤酒廠也盡量避免出現傳代次數過多的問題[4]。

啤酒酵母根據發酵結束后酵母細胞在發酵液中活動的狀態可分為兩類，分別為上面啤酒酵母和下面啤酒酵母。上面啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)又稱艾爾酵母(ale yeast)，多用于生產艾爾型啤酒，而下面啤酒酵母又稱拉格酵母(lager yeast)，用于發酵拉格型啤酒。目前世界上大多數工業啤酒生產中使用拉格酵母進行發酵，通常所說的啤酒酵母也大多指拉格酵母。早期對lager酵母的研究認為其是由不同酵母菌株包括S.cerevisiae,S.bayanus,S.bayanusvar.uvarum雜交而來[5-6]。 2008年Dunn和Sherlock對17株lager酵母進行基因組分析證明了其雜交本質，并指出lager酵母的S.cerevisiae部分的親本很可能是艾爾酵母[7]。而真貝酵母(S.eubayanus)菌株的發現進一步確定了lager酵母是由艾爾酵母S．cerevisiae與S.eubayanus雜交而產生的雜交體[8]。在基因組學研究的基礎上，將拉格酵母分為了2組，分別為第1組Saaz/Carlsberg型酵母(S.carlsbergensis)和第2組Forhberg型酵母(S.pastorianus)[9]。研究發現，Forhberg型酵母能夠利用麥芽三糖而Saaz型酵母不能利用[9]。雖然拉格酵母與釀酒酵母所表現出來的親緣性很高，但兩者在物質代謝尤其是風味物質代謝調控上卻有很大的差別，而且與啤酒風味代謝相關的基因基本上都來自于其“非釀酒酵母”(non-cerevisiae)部分的親本[10]。真貝酵母低溫耐受性非常好，因此，來自于真貝酵母的這部分基因賦予了啤酒酵母在低溫條件下良好的發酵能力。

在啤酒傳代發酵過程中，酵母細胞需要應對環境中的各種壓力，包括滲透壓力、氧化壓力、乙醇壓力等(圖1)，當酵母細胞感受到壓力或者對細胞來說產生一種毒性刺激而無法抵御時，細胞將啟動自溶程序[11]。 不同于葡萄酒酵母的自溶會給葡萄酒帶來面包、黃油等愉悅的香氣[12-13]，啤酒酵母自溶過程中大量的胞內物質泄漏到發酵液中，對啤酒的風味和品質造成不利的影響[1-2, 14-15]。通過選育耐壓力脅迫的啤酒酵母能夠一定程度上提高酵母的抗自溶能力[16]，然而并不是非常理想。目前國內外少有針對啤酒酵母在傳代過程中的生理變化進行研究，因此深入理解酵母在自溶脅迫過程中的生理變化，不僅有助于了解啤酒酵母傳代過程中的抗自溶脅迫機制，還可以為選育優良啤酒酵母提供指導意義。

圖1 發酵過程中酵母受到的各種壓力變化[17]Fig.1 Various stresses encountered by the yeast during brewing process

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

啤酒酵母Pilsner和5-2均為拉格酵母菌株，主要用于拉格型啤酒的釀造，由本實驗室保藏。酵母提取物和胰蛋白胨均購自北京OXOID公司；2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)，購于Sigma-Aldrich公司；BacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability Assay試劑盒，購于Promega公司；細胞凋亡檢測試劑盒(紅色熒光)，購于Beyotime公司；其他試劑均為國產分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基和溶液

YPD培養基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物，20 g/L葡萄糖。

檸檬酸鹽緩沖液：10.51 g/L檸檬酸，14.71 g/L三水檸檬酸鈉，用1 mol/L檸檬酸溶液調節pH至4.0。

亞甲基藍染色液：美藍0.3 g，95%乙醇30 mL，0.1 g/L KOH 100 mL，使用時稀釋10倍。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na2HPO4，0.74 g/L KH2PO4，用HCl調節溶液pH值在7.2～7.4。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母細胞的傳代發酵

從保藏的菌株斜面上取1環菌接入 10 mL YPD試管中，于 28 ℃下活化36 h，按1%的接菌量加入到70 mL的三角瓶中于 25 ℃培養48 h，最后按照酵母細胞濃度 2×107CFU/mL接入2 L帶發酵栓的錐形瓶中，進行發酵。拉格型酵母Pilsner和5-2于11 ℃下發酵6 d。等發酵結束后，收取新鮮的酵母泥，按照相同的接種量進行傳代發酵，直至第5代。

1.2.2 酵母細胞形態學觀察

收集每代發酵結束后的新鮮酵母細胞，用5%戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH=7.2)前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗1%鋨酸(0.1 mol/L 磷酸緩沖液，pH=7.2)后固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗，乙醇梯度脫水，臨界點干燥后將樣品粘貼在樣品臺上，離子濺射儀鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察其細胞形態[18]，而超薄切片經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后置于透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞死亡率和活性檢測

定時對自溶液取樣，適當稀釋后與等量亞甲基藍染液混勻，染色5 min后用血球計數板鏡檢計數。細胞呈藍色的為死細胞，無色的為活細胞，記錄細胞總數和死細胞數(細胞活性=活細胞數/細胞總數×100%)。

1.2.4 抗自溶指數的檢測

參考許維娜等[11]研究方案，將2 g主發酵結束后的酵母泥加到200 mL檸檬酸鹽緩沖液(模擬自溶液)中，28 ℃靜置培養72 h，每12 h取樣檢測各指標。取1 mL樣品在3 000×g離心5 min，沉淀酵母細胞用于檢測死亡率，上清液用于測定在260 nm和280 nm處的吸光度。根據2個吸光值與酵母死亡率的比值判定酵母的抗自溶性能。

1.2.5 基于ATP檢測細胞活力

參考BactTiter-GloTMMicrobial Cell Vitality Assay試劑盒說明書，進行細胞ATP的檢測。細胞懸浮在100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，0.1%葡萄糖和1 mmol/L EDTA)中，并使細胞濃度控制在106CFU/mL左右，取100 μL進行檢測。這個化學發光的光信號在5 min后就可用TECAN Infinite?200 多功能酶標儀進行檢測，而且發光信號跟ATP的含量成正比。

1.2.6 細胞內ROS檢測

參考ANNA LEWINSKA實驗方法[19]，將細胞懸浮在pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中，并使細胞濃度控制在107CFU/mL左右。取1 mL樣品，加入 5 μL DCFH-DA于37 ℃避光反應30 min，然后用多功能酶標儀檢測熒光強度(測試條件：λex=488 nm和λem=525 nm)。

1.2.7 DNA的相對損傷分析

利用TdT介導dUTP缺口末端標記法(TUNEL)染色來檢測DNA 的損傷[20-21]。具體的操作是參考細胞凋亡檢測試劑盒(紅色熒光)說明書，用4%多聚甲醛固定1 h，溶壁酶在37 ℃處理40 min，最后加TUNEL反應混合物在37 ℃黑暗中培養1 h，結果通過熒光顯微鏡來計數，至少有200個細胞計數，以確定DNA損傷。

2 結果與分析

2.1 細胞形態學分析

2.1.1 細胞表面形態分析

對0代、3代及5代的酵母細胞進行微觀形態觀察，掃描電鏡結果如圖2所示，放大倍數為3 000倍。發現酵母細胞在0代多呈橢圓形，表面圓潤飽滿，有明顯的出芽現象和芽痕，但是在經過連續的傳代發酵后，酵母細胞的表面就逐漸出現褶皺變化，甚至由于胞內物質的流失導致細胞干癟失形，但是細胞表面依舊無明顯破損。這說明在連續傳代發酵過程中酵母細胞壁的破壞是局部的、小規模的，也反映了細胞壁在抗壓方面所起到的重要作用。同時，相對于菌株5-2，可以清晰地看出菌株Pilsner在傳代過程中，細胞形態變化較大，受損較嚴重，同時細胞表面也出現了干癟失型，這也說明了在傳代發酵過程中，菌株5-2抗壓能力優于菌株Pilsner。

圖2 不同代數啤酒酵母的掃描電鏡(SEM)結果Fig.2 SEM analysis of lager yeasts from different generationsa.b.c分別為Pilsner菌株的0、3、5代的SEM結果；d.e.f 分別為5-2菌株的0、3、5代的SEM結果，放大倍數3 000倍

2.1.2 細胞壁厚度分析

通過酵母細胞的切片透射電鏡圖可以清晰地觀察酵母細胞的內部結構形態，也可以清楚的觀察到酵母細胞壁的狀況，利用標尺可以測定不同代數的酵母細胞壁厚度。圖3為Pilsner和5-2菌株0、3、5代細胞的切片透射電鏡圖，放大倍數為 15 000 倍。每株菌選取 50個未發生芽殖的細胞，測定不同位置細胞壁厚度，進行平均后得到的酵母壁細胞壁厚度如表1所示。

圖3 不同代數啤酒酵母的切片投射電鏡(TEM)結果Fig.3 TEM analysis of lager yeasts from different generationsa.b.c分別為Pilsner菌株的0、3、5代的TEM結果；d.e.f 分別為5-2菌株的0、3、5代的TEM結果，放大倍數15 000倍

表1 不同代數啤酒酵母的細胞壁厚度

單位：nm

根據圖3所示，可以很明顯看到在經過連續傳代發酵后，細胞內的脂質、蛋白質等物質會被逐漸水解，這也解釋了為什么細胞的表面形態會在連續傳代后出現褶皺變化，甚至干癟失形。相對于菌株5-2，Pilsner細胞的內部結構水解程度更大，因此才導致其細胞形態變化相對更大。如表1所示，發現2個菌株的細胞壁厚度都在逐漸下降，只是不同菌株的下降趨勢不同，其中菌株Pilsner在經過5代發酵后，由開始的233 nm下降到173 nm，厚度減少了25.8%，菌株5-2由開始的212 nm下降到186 nm，厚度只減少了12.3%。酵母細胞壁是一個動態的且被調控地非常有序的細胞結構，其在保護細胞應對壓力上發揮著重要作用[22-23]。所以細胞壁厚度相對薄的Pilsner菌株在經過多次傳代后，細胞形態變化較大，胞內受損嚴重，表現出的抗壓能力較5-2弱。

2.2 酵母模擬自溶分析

收集每一代發酵結束的酵母泥進行模擬自溶分析，結果如圖4所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖4 不同代數啤酒酵母模擬自溶液中(A260/A280)/死亡率隨時間的變化情況Fig.4 Changes of (A260/A280) /mortality rate of lager yeastsfrom different generations in citrate buffer

隨著傳代次數以及自溶時間的增加，菌株的抗自溶指數均發生逐漸下降的趨勢，不同菌株下降趨勢不同。在模擬自溶條件下，Pilsner和5-2的抗自溶指數分別由0代的83和97，下降到3代的40和62，分別下降了51.8%和36.1%，到第5代時，Pilsner和5-2的抗自溶指數已經達到21和42，下降了47.5%和32.3%，Pilsner菌株的抗自溶指數下降趨勢遠大于5-2菌株。另外，隨著自溶時間的延長，不同代數的菌株細胞也是隨著其代數的增加，抗自溶指數下降趨勢變化越加緩慢。由于菌株在傳代過程中會逐漸衰老，越加難以抵抗一些惡劣的環境影響，因此可能導致其細胞的自溶[14, 24]。抗自溶指數的下降意味著抗自溶能力的下降，從圖中可以很明顯地發現5-2菌株的抗自溶能力強于Pilsner菌株，所以5-2相對來說能更好地抵御環境的影響。

2.3 傳代發酵及自溶過程中細胞活性及活力研究

2.3.1 細胞活性及活力分析

2.3.1.1 細胞活性分析

檢測分析2個菌株在傳代以及自溶過程中的細胞活性，結果如圖5所示，Pilsner和5-2的細胞活性在傳代發酵過程中緩慢下降，經過5代發酵后細胞活性從98.9%下降到95.8%和96%，分別下降了3.1%和2.9%。然而，在自溶過程中細胞活性則下降迅速，下降幅度分別達到37.9%和65.9%。在饑餓狀態下細胞活性的下降主要是靠細胞自身的抗逆性來維持，所以通過分析上述數據可以明顯地發現，5-2菌株細胞抗逆性強于Pilsner。另外，結合細胞抗自溶研究的結果，發現細胞活性高的菌株，其抗自溶能力也較強。因此在啤酒發酵過程中測定酵母細胞的活性對工業化生產具有重要的指導意義[25]。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖5 傳代發酵及自溶過程中啤酒酵母細胞活性變化情況Fig.5 Changes of cell viability of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

2.3.1.2 基于ATP含量的細胞活力分析

細胞活力與細胞內ATP含量密切相關[26]，因此了解ATP含量變化對細胞活力有著重要作用。通過熒光素-熒光素酶反應檢測ATP，其發光信號強度與細胞內ATP含量成比例，由于它的靈敏度和執行速度，使其成為一個應用廣泛的檢測細胞活力的方法，ATP檢測結果用相對光單位(RLU)來表示。如圖6所示，ATP含量在傳代過程以及自溶條件下都出現急劇下降趨勢。在傳代過程中，Pilsner和5-2的胞內ATP含量由開始的5 400 RLU和7 600 RLU到3代時下降為2 000 RLU和3 300 RLU，分別下降了63.0%和56.6%，到了第5代，其ATP含量已經下降到1 200 RLU和2 300 RLU，與第3代相比又下降了40.0%和30.3%。顯然Pilsner的胞內ATP含量下降趨勢遠大于5-2，而且初始的ATP水平又遠低于菌株5-2，說明其細胞活力弱于5-2。此外，在自溶條件下，發現2株菌株的ATP含量下降趨勢都是在0～24 h內迅速下滑，24 h后下降趨勢有所緩和，這跟細胞的抗自溶指標變化趨勢類似，說明細胞活力與細胞抗自溶能力也有一定的相關性。另外，從細胞活性來看，Pilsner和5-2在傳代的過程中，從0代到5代其菌株的細胞活性下降不足5%，但是這2個菌株的胞內ATP水平卻急劇下降到約70%。這表明細胞活性不足以評價啤酒酵母在釀造過程中的生理能力，所以就需要結合兩者來評估細胞的生理狀態，來反映細胞的活力。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖6 傳代發酵及自溶過程中啤酒酵母細胞ATP含量變化情況Fig.6 Changes of ATP levels of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

2.3.2 胞內ROS積累評價

ROS的檢測結果用相對熒光單位(relative fluorescent unit, RFU)表示，所以確保相同細胞數量很關鍵。對2株菌株傳代以及自溶過程中胞內ROS積累進行檢測，結果如圖7所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖7 傳代發酵及自溶過程中啤酒酵母細胞內ROS變化情況Fig.7 Changes of ROS levels of lager yeasts from differentgenerations in the process of fermentation and autolysis

發現2株菌株胞內ROS的含量在傳代過程中都出現逐漸積累現象。從0代發酵結束至5代發酵結束，Pilsner和5-2的胞內ROS含量分別從520 RFU和320 RFU，積累到1 400 RFU和740 RFU，分別上升了169%和131%。高活力活性的菌株，其產生的ROS含量相對少，且穩定。而本文的結果跟前人的研究結果[27]類似，都出現ROS積累現象。近年來研究表明，酵母細胞的復制老化伴隨著活性氧在母細胞中的積累。此外，也有研究表明，線粒體已被確定為ROS產生的主要來源[28-29]。所以線粒體ROS的增加進一步導致了整個細胞內的ROS的積累。然而，在自溶條件下，菌株都出現了先下降后上升的波動。有研究表明，為了防止細胞氧化損傷，酵母細胞會啟動氧化應激反應，包括酶和非酶防御機制來消除ROS[30]。這就很好的證明了為什么在自溶條件下，ROS會出現下降的趨勢。而在惡劣條件下，細胞就會出現氧化應激現象，這導致了ROS生成和消除之間的不平衡，最終積累了更多的ROS。另外，Pilsner菌株產生的ROS遠高于菌株5-2，而過多的ROS則會嚴重影響細胞的生理功能，所以這也間接表明，5-2細胞活力比Pilsner更強。

2.3.3 細胞DNA損傷評價

DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)的催化下加熒光探針標記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)法在單細胞水平上檢測DNA損傷的方法原理[31]。TUNEL法已被廣泛用來評估酵母在復制衰老和時序衰老過程中DNA的損傷[27, 32]。在連續傳代的過程中和自溶條件下的DNA損傷情況，結果如圖8所示。

a-啤酒酵母Pilsner；b-啤酒酵母5-2圖8 傳代發酵及自溶過程中啤酒酵母細胞DNA損傷變化情況Fig.8 Changes of DNA damage of lager yeasts fromdifferent generations in the process of fermentationand autolysis

細胞的DNA損傷情況在傳代和自溶過程中都越來越嚴重，而且很明顯的看到，Pilsner菌株的DNA損傷率在第2代就出現迅速上升，整體都高于5-2，而且DNA的損傷趨勢與ATP下降趨勢表現幾乎一致，說明酵母細胞ATP變化與DNA損傷有直接關系。另外，在前面的研究中，發現酵母在發酵過程中，尤其是自溶過程中，會伴隨著ROS大量積累，而ROS的積累又進一步增加DNA的損傷，因此造成DNA的迅速損傷，如圖9所示。

a.b.c分別為菌株Pilsner的0、3、5代的DNA損傷熒光結果，d.e.f 分別為菌株5-2的0、3、5代的DNA損傷熒光結果，其中紅色細胞表示DNA受損傷的細胞圖9 不同代數啤酒酵母細胞DNA損傷熒光圖Fig.9 DNA damage fluorescence of lager yeasts fromdifferent generations

3 結論

在工業化啤酒釀造過程中，為降低經濟成本，酵母細胞會被多次傳代重復使用，然而在傳代過程中，啤酒酵母需要重復應對環境中的氧化壓力、滲透壓力等各種壓力，這些壓力會引起酵母質量的下降。當酵母細胞無法抵御所受壓力時，細胞開始自我降解，從而引起酵母的自溶衰亡，而酵母自溶又會給啤酒的風味、品質帶來極其不利的影響。

本研究從生理學角度深度分析了啤酒酵母在傳代過程中細胞形態、自溶性能、細胞活性活力等指標，結果發現:(1)在傳代培養過程中，原本表面圓潤飽滿的酵母細胞會在活力下降后出現褶皺，甚至因為細胞內部結構的嚴重水解而干癟失型。同時，細胞壁厚度在傳代過程中也會逐漸變??；(2)在模擬自溶液中，菌株的抗自溶能力隨著傳代次數的增加而逐漸減弱，其中菌株Pilsner自溶程度和死亡率明顯高于5-2；(3)在傳代發酵及自溶過程中，2個菌株的細胞活性均呈緩慢下降趨勢，而兩者的細胞活力則呈現迅速下降趨勢。在細胞活性下降5%時，Pilsner和5-2的胞內的ATP水平已經急劇下降達到70%，因此需要結合兩者來評估細胞的生理狀態，來反映細胞的活力；(4)高活力的菌株其所表現的抗自溶能力、抗壓能力都很強，而且高活力的菌株所產生的ROS含量相對少，且穩定，基本維持在300～1 000 RFU，DNA損傷速度也會相對緩慢。另外，胞內ROS的積累也會增加DNA的損傷。研究啤酒酵母在傳代及自溶過程中的生理性能變化，不僅對現有生產菌株的優劣和傳代能力進行評價，對選育優良啤酒酵母也具有重要指導意義。