蚓激酶基因在畢赤酵母中的表達及其發酵條件優化

江鵬，湯斌

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

蚓激酶(Lumbrokinase，LK)是從蚯蚓體內發現的一組同時具有纖溶活性和激酶活性的絲氨酸蛋白酶[1]。該酶能夠刺激纖溶酶原轉變成纖溶酶，從而催化纖維蛋白，起到溶血栓作用[2]。臨床試驗表明，蚓激酶還可用于預防和治療冠心病、腦梗塞、肺心病和下肢深靜脈血栓等疾病[3-4]。該酶穩定性良好，酶制劑既能口服，亦可注射，已得到廣泛應用[5-6]。目前，市售蚓激酶主要來源于蚯蚓粉末的提取純化，此法所得產品純度較低且產量少。因此，通過異源表達生產高純度的蚓激酶已成為未來蚓激酶工業化生產的趨勢[7]。

近年來，研究者已從不同種類蚯蚓中克隆得到蚓激酶編碼基因，并在大腸桿菌中進行表達，但目的蛋白多以包涵體形式存在，因而沒有纖溶活性[8-11]。相較于原核表達系統，畢赤酵母表達系統具有胞外分泌且易于純化目的蛋白的優勢[12-14]。趙明明[15]等首次在畢赤酵母中成功表達了蚓激酶F238基因，酶活最高為100 U/mL。隨后，宋馨宇[16]等人通過G418抗性梯度篩選獲得1株耐高抗性的GS115-pPIC9K-F238菌株，搖瓶培養84 h后達蚓激酶酶活峰值257.6 U/mL。然而，目前蚓激酶在畢赤酵母中表達研究的報道較少，且表達量較低，遠不能應用于工業化生產[15-16]。

為了提高蚓激酶在畢赤酵母表達系統中的產量，本文從重組菌誘導表達條件出發，優化初始菌體量、pH和溫度，并研究氨基酸對蚓激酶在酵母中表達的影響，最終通過高密度發酵手段實現蚓激酶基因在畢赤酵母中的大量表達，為今后蚓激酶的工業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蚯蚓樣本：獲自校園土壤中，經本實驗室分子生物學鑒定為赤子愛勝蚓。本文所用E.coliJM109、畢赤酵母GS115、pPIC9K質粒均為安徽工程大學微生物發酵研究中心保藏菌種，pMD18-T載體購自上海Sangon公司。Trizol試劑、尿激酶、購自上海Sangon公司，牛血纖維蛋白原、凝血酶購自Sigma公司，其他試劑購自國藥。

1.2 蚓激酶基因的克隆及表達

利用Trizol法提取赤子愛勝蚓總RNA，試劑盒法反轉錄合成cDNA。通過GenBank數據庫搜索蚓激酶編碼序列，經比對分析設計引物對Primer 1-F+Primer 1-R。以cDNA為模板克隆目的基因，并將其連接pMD18-T載體，送上海生工測序。根據測序結果設計引物對Primer 2-F+Primer 2-R。PCR產物和質粒同時用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，連接后轉化E.coliJM109，篩選得到重組質粒pPIC9K-lks2送上海生工測序。引物見表1。利用SacI酶對該重組質粒進行線性化，電轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，利用MD平板進行篩選，并提取轉化子基因組DNA，進行PCR驗證。挑取MD平板上的酵母單菌落接種于YPD培養基中，30 ℃，220 r/min培養18 h。按1%量接種于30 mL BMGY培養基中，30 ℃，220 r/min培養至OD600值為2～6，離心去上清收集菌體，將菌體重懸于 30 mL BMMY 培養基中，30 ℃，220 r/min振蕩培養，每隔24 h加體積分數0.5%甲醇進行誘導表達。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

注：下劃線為酶切位點。

1.3 蚓激酶活力測定方法

本文采用國標法[17](纖維蛋白平板法)測定蚓激酶活力：制備纖維蛋白平板，將梯度濃度的尿激酶標準品點樣于纖維蛋白平板上，放置10 min后移入37 ℃培養箱，保溫18 h取出測量溶圈垂直的2個直徑，并計算2個直徑的乘積，重復測定3次，求平均值。以測定不同濃度的溶圈垂直直徑乘積(A)的對數為縱坐標，標準品尿激酶濃度(C)的對數為橫坐標繪制標準曲線。線性回歸方程為：lnA=0.864lnC+2.047 7，R2=0.969 8。

1.4 蚓激酶畢赤酵母重組菌的發酵條件優化

基礎誘導培養基為BMMY，誘導溫度30℃，裝液量30%，搖床轉速220 r/min，甲醇添加量體積分數為0.5%。誘導初始菌體量優化：初始OD600分別為0.5、1、1.5、2和2.5，取發酵液上清以纖維平板法測纖溶活力。誘導pH值的優化：在上述優化基礎上，調整初始pH值分別為4.5、5、5.5、6、6.5和7，以纖溶活力確定最佳pH值。誘導溫度的優化：上述優化基礎上，設置初始溫度分別為26、28、30、32、34 ℃，同樣根據纖溶活力確定最佳誘導溫度。

氨基酸對重組菌產酶的影響：在BMMY培養基中分別添加體積分數為0.1%的不同種類氨基酸，對照組不加氨基酸，誘導84 h后取樣檢測酶活力。

1.5 重組畢赤酵母發酵罐放大培養

1.5.1 種子培養

一級種子液：挑取MD平板上的重組菌，接于10 mL YPD中，30 ℃，220 r/min培養18 h，OD600值為12左右。

二級種子液：按1%的接種量取一級種子液接于350 mL BMGY中，30 ℃，220 r/min培養至OD600值為6～7。

1.5.2 發酵過程控制

10 L發酵罐裝液量6.5 L，培養基為BSM培養基，添加體積分數為0.1%的絲氨酸，PTM1添加量為4 mL/L培養基，通過氨水調節pH 5.0。將二級種子液接入發酵罐中，根據畢赤酵母表達手冊進行菌體的前期培養，控制DO為40%，發酵pH值為5.0，培養溫度30 ℃，通氣量為0.5 vvm，罐壓0.08 MPa。待菌體濕重達到200 g/L左右后，停止流加甘油。溶氧上升后，饑餓培養0.5 h，開始甲醇誘導。誘導過程嚴格控制甲醇流加速率使DO在40%小幅波動，氨水調節pH值控制在5.5，誘導溫度28 ℃，通氣量為0.6 vvm，罐壓控制在0.08 MPa。

1.5.3 菌體初始濃度優化

將450 mL二級種子液離心，去上清，用100 mL BMMY培養基洗勻菌體，全部接入發酵罐中，取發酵液離心測得菌體濕重為3±0.5 g/L，以此為基準，通過控制加入的二級種子液的量來使得接種后發酵罐中菌體初始質量濃度分別為3±0.5、6±0.5、9±0.5和12±0.5 g/L，培養條件均一致。發酵過程每隔12 h取樣，測菌體濕重和蚓激酶活力。

2 結果與分析

2.1 蚓激酶基因的克隆及分析

目前在GenBank數據庫中已公布的蚓激酶編碼序列共有19條，其中F238基因[17-19](GeneBank No. DQ202401)的相關研究最多。本文從赤子愛勝蚓中擴增得到蚓激酶基因lks2，全長738 bp，編碼246個氨基酸(圖1-A)。比對結果顯示，lks2與F238基因同源性為99.59%，其中第136、175和398位堿基不同，導致編碼的46和59位氨基酸發生差異(圖2)。

圖1 蚓激酶基因克隆(A)、表達載體雙酶切(B)和重組菌基因組PCR(C)Fig.1 Lumbrukinase gene cloning (A), expression vectordouble enzyme cutting (B) and recombinant bacterialgenome PCR (C)

圖2 lks2基因與F238基因的差異Fig.2 The difference between lks2 gene and F238 gene

2.2 蚓激酶基因在畢赤酵母中的表達

將lks2與pPIC9k質粒相連接，雙酶切驗證結果顯示表達載體pPIC9K-lks2構建成功(圖1-B)。將該表達載體電轉化畢赤酵母，獲得重組菌GS115-pPIC9K-lks2，經轉化子基因組DNA的PCR驗證結果顯示構建成功(圖1-C)。將該重組菌進行搖瓶發酵試驗，取不同誘導時間的發酵上清適當稀釋，點樣于纖維蛋白平板。結果顯示，重組畢赤酵母的蚓激酶酶活在84 h達到峰值254.4 U/mL(圖3)。

圖3 重組菌纖溶活力測定Fig.3 Fibrinolytic activity of GS115-pPIC9K-lks2

2.3 重組菌GS115-pPIC9K-lks2的發酵條件優化

2.3.1 誘導初始培養條件優化

畢赤酵母甲醇誘導過程中需要消耗大量的氧，當菌體濃度較低時培養基成分和供氧量充足，但隨著菌體量的增加使得培養基中溶氧降低，從而影響菌體代謝，因此接種量對重組菌產酶影響較大。通過調整初始OD600值來研究初始菌體量對重組菌GS115-pPIC9K-lks2的影響，不同接種量的產酶變化趨勢基本一致，達到最高酶活時間點均是誘導84 h。當OD600=1.5時，蚓激酶酶活最高，峰值為288 U/mL(圖4-A)。在此基礎上優化誘導pH值和溫度，結果如圖4-B,C所示，最佳誘導初始pH值為5.5，最適誘導溫度為28 ℃，此條件下蚓激酶酶活峰值達364.4 U/mL。

2.3.2 氨基酸添加對重組菌產酶的影響

氨基酸是構成蛋白質的基本組成，通過添加氨基酸可在一定程度上加快目的蛋白的合成。本文在BMMY培養基中添加各類氨基酸，研究不同氨基酸對重組菌的產酶影響。結果如圖5所示，絲氨酸、甘氨酸和異亮氨酸的添加對重組菌產酶有促進作用，其中以絲氨酸效果最佳。添加0.1%絲氨酸后，蚓激酶酶活達到397.6 U/mL。這可能是絲氨酸在菌體代謝過程中影響了重組菌合成蛋白的能力，對外源基因表達過程起到一定的調控作用。

圖4 重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-lks2的發酵條件優化Fig.4 Optimization of fermentation conditions for the GS115-pPIC9K-lks2

2.4 重組菌發酵罐放大培養

在搖瓶優化基礎上，利用10 L發酵罐對重組菌GS115-pPIC9K-lks2進行放大培養及高密度發酵條件研究。種子液濃度為OD600=6時進行上罐發酵，此時菌體處于對數生長期，代謝能力強，有利于擴大培養。由于初始菌體量對畢赤酵母蚓激酶的高效表達具有重要影響，本文對發酵罐初始菌體接種量進行了比較研究。結果如圖6-A所示，初始菌體量的增加有利于提高菌體生長速率，達到在相同時間內迅速增加菌體密度的目標。隨著菌體密度增加，蚓激酶活力迅速上升，最佳接種菌濃度為9±0.5 g/L(圖6-B)。此外，初始接種量的增加可顯著縮短發酵周期。當菌體初始濃度為9±0.5 g/L時，誘導前期培養時間較優化前(3±0.5 g/L)縮短了11.5 h，蚓激酶酶活提高了1.08倍(3±0.5 g/L，蚓激酶酶活為527.8 U/mL)，達到1 098.2 U/mL。

圖5 不同氨基酸對產酶影響Fig.5 Different amino acid effect on enzyme production

圖6 發酵罐放大培養Fig.6 Fermentation tank amplification culture

3 討論

蚓激酶屬于絲氨酸蛋白酶，其編碼基因已經成功在細菌、真菌和動植物中實現表達。本文研究了蚓激酶在畢赤酵母中的異源表達，并通過誘導條件優化及高密度發酵研究，有效提高了蚓激酶的產量并縮短了發酵周期，突破了目前畢赤酵母蚓激酶表達量低的瓶頸，具有重要的工業應用價值。

本研究通過對重組菌GS115-pPIC9K-lks2的誘導條件優化，發現誘導初始菌體密度對產酶效果影響較大。菌體密度過低，會導致菌體生長環境中相對甲醇量偏高，從而產生毒性影響菌體正常代謝。甲醇誘導畢赤酵母產酶過程需要消耗大量的氧氣，因此菌體密度過高會導致溶氧不足，造成菌體無法有效利用碳源維持自身生存，同樣影響產酶能力。因而，確定最佳誘導初始菌體密度對蚓激酶在畢赤酵母中的表達十分關鍵。本文在搖瓶培養和發酵罐擴大培養過程中完成了最佳初始菌體量的優化，從而顯著提升了蚓激酶的產量，為其大規模生產提供了方向。