兩種多酚對馬鮫魚魚糜凝膠特性的改善

賈慧, 夏儷寧, 李琦, 徐暢, 董秀萍, 潘錦鋒*

1(大連工業大學 食品學院，遼寧 大連，116034) 2(國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連，116034)

魚糜制品是魚肉加入食鹽，經斬拌使肌原纖維蛋白溶出，加熱后蛋白交聯形成的具有有序空間網絡結構的彈性凝膠食品。魚糜制品品質特性包括凝膠特性、顏色、持水性等，其中凝膠特性是最重要的指標。為提高魚糜凝膠強度，不少食品添加物，如淀粉、明膠、大豆蛋白、乳清蛋白、血漿蛋白等被用于魚糜凝膠特性的改良。非魚蛋白的加入違背了魚糜制品的初衷，降低了蛋白含量，使其營養價值、風味特征受到質疑。

多酚是一類具有若干酚性羥基結構的物質，大都具有良好的抗氧化作用，不少亦可抑制微生物生長，是良好的食品添加劑[1]。多酚類物質主要存在于植物如谷物、水果、茶葉等[2]，其天然性和安全性高，消費者接受度高。研究發現，多酚類物質可以有效提高蛋白質的交聯[3-6]，該作用主要源于多酚物質的氧化中間產物醌類物質，后者可以促進蛋白質中賴氨酸、蛋氨酸、絲氨酸的氧化交聯，形成更為穩定的網絡結構[7-8]，同時多酚類物質本身也可促進次級作用力，如氫鍵、疏水作用，使網絡結構更加穩定。目前，多酚物質對于肌肉蛋白作用研究主要見于肉類，魚肉中研究的較少。

馬鮫魚，又名鲅魚，是我國重要的海洋經濟魚種之一，2016年產量達43.29萬t[9]。由于馬鮫魚肌原纖維蛋白的凝膠性能較弱，如何提升其凝膠特性是馬鮫魚凝膠產品開發的關鍵。本文以馬鮫魚魚糜為原料，考察綠原酸、咖啡酸及其氧化形式對馬鮫魚魚糜凝膠特性的作用；以及馬鮫魚魚糜的凝膠強度、顏色、持水性、水分分布及微觀結構變化，為提升馬鮫魚魚糜凝膠制品品質提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

深度冷凍馬鮫魚(10月捕撈、速凍，體重1.2～1.5 kg),購于大連市新長興市場；塑料腸衣,東北往事特產店；綠原酸、咖啡酸,上海笛柏化學品技術有限公司。

1.2 實驗儀器

HH-1數顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；AB204-N電子分析天平，常熟市雙杰測試儀器廠；NMI20低場核磁共振分析儀(LF-NMR)，上海紐邁電子科技有限公司；CM1950冰凍切片機，德國徠卡(Leica)；TA.XT.plus物性測試儀，美國亨特立公司；UltraScan PRO測色儀，美國亨特立公司；掃描投射電鏡(SEM)。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚糜制備

冷凍馬鮫魚，室溫解凍，去頭、去皮、去內臟、去紅肉，所得魚肉攪碎，采用BALANGE 等[10]的修改方法進行漂洗。首先次用冰冷去離子水，以1∶3比例漂洗4 min，重復1次。再用冰冷的0.5%NaCl溶液漂洗1次，4 min，然后進行擠壓脫水。脫水后的魚糜加入4%木糖醇和4%山梨糖醇，混合均勻后每袋200 g進行分裝，采用-80 ℃速凍40 min 后于-20 ℃貯藏，2個月內使用完畢。

1.3.2 氧化多酚的制備

氧化綠原酸和氧化咖啡酸，按照BENJKUL等[11]方法進行氧化。將多酚以1∶100(g∶mL)的比例溶于去離子水，用6 mol/L NaOH和HCL調節pH到8，使其完全溶解。然后在氮吹儀中，60 ℃下通入氧氣氧化2 h，將多酚轉化為醌類物質。氧化后采用6 mol/L HCL將多酚溶液pH調至7。未氧化多酚不經通氧氣，直接調節pH到8，溶解即可。記綠原酸添加組魚糜為CHA(chlorogenic acid)，氧化綠原酸添加組為OCHA(oxidized-chlorogenic acid)，咖啡酸添加組為CA(caffic acid)，氧化咖啡酸添加組為OCA(Oxidized-caffic acid)。

1.3.3 魚糜凝膠制備

將冷凍魚糜室溫緩凍30 min，直到中心溫度達-2 ℃。于10 ℃下斬拌1 min分別加入不同體積的多酚或氧化多酚溶液，使得最終多酚或氧化多酚與蛋白質量比為0%，0.15%，0.30%，0.45%。各體系最終補充水分含量到相同的水分含量83%。所得魚糜繼續斬拌2 min，再加入2.5%的食鹽斬拌2 min，而后魚糜灌入直徑20 mm的腸衣，采用二段加熱法(40 ℃ 30 min，再90 ℃ 20 min)制備魚腸凝膠所得魚腸于冰水中冷卻，并置于4 ℃冰箱過夜儲藏，24 h測定各類性質。

1.3.4 凝膠強度測定

凝膠強度測定法方參照BALANGE等[12]，略作修改。將經1.3.3所制凝膠切成高20 mm、直徑20 mm圓柱體，采用物性測試儀測定凝膠強度。測試條件：測試探頭型號P/5S；測前速度1.00 mm/s，測試速度1.00 mm/s，返回速度10.00 mm/s；下行距離15 mm。每個條件重復測定6次。

1.3.5 顏色測定

顏色測定法方參照ARFAT等[13]，稍加修改。將1.3.3所得魚腸樣品切成高20 mm圓柱體，利用測色儀HunterLab測定L*，a*，b*值，由以下公式計算結果。每個條件重復6次，白度W計算參照公式(1)。

(1)

式中：L*為明度(黑暗色(0)到明亮色(100))，a*為紅色(60)到綠色(-60)，b*為黃色(60)到藍色(-60)。

1.3.6 持水性(WHC)測定

持水性參照ZHOU等[14]的方法并作修改。將經1.3.3所得魚腸取3 g左右，稱取質量為m1，切碎，用濾紙吸取表面的水分，于4 ℃下，10 000g離心 10 min，稱取質量為m2。持水性計算參照公式(2)。

(2)

1.3.7 LF-NMR的水分分布測定

魚肉凝膠香腸的水分分布參照HAN等[15]方法并作修改。將經1.3.3所得香腸切成20 mm高圓柱體，置于核磁管內，采用低場核磁共振分析儀，利用CPMG脈沖序列測定魚腸水分的橫向弛豫時間T2，測定采用如下運行參數：線圈直徑60 mm，頻率21 MHz，溫度(32±0.01) ℃，TD 360020，NS 4。每個樣品重復掃描3次，使用SIRT算法擬合所得指數衰減圖得T2譜圖。每組重復6個樣品。

1.3.8 微觀結構

魚肉凝膠微觀結構采用BALANGE等[16]方法進行觀察。將經1.3.3所得樣品切成2～3 mm的薄片，截面修成5 mm×5 mm的正方形；用2.5%的戊二醛溶液(溶于0.2 mol/L的磷酸緩沖液，pH=7.2)4 ℃浸泡， 過夜，用去離子水反復洗滌3次，每次10 min。然后分別用體積分數為50%，70%，80%，90%的乙醇溶液進行梯度脫水各10 min，隨后用100%的乙醇溶液脫水3次，每次30 min。再用V(乙醇)∶V(叔丁醇)=1∶1的溶液將樣品浸泡15 min，使其充分的進行置換，最后用100%的叔丁醇4 ℃進行浸泡15 min。所得樣品冷凍干燥后粘在銅臺上，樣品表面進行噴金，采用掃描電子顯微鏡觀察樣品。

1.4 統計分析

采用SPSS 19.0對數據進行單因素方差分析ANOVA，并采用Turkey法進行多重比較，顯著性水平取p<0.05。

2 結果與分析

2.1 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠強度的影響

不同質量分數CHA、OCHA、CA、OCA作用下的馬鮫魚魚糜凝膠破斷力和凹陷度如圖1所示。與對照組相比，多酚添加組的魚糜凝膠破斷力均有一定程度上升(p<0.05)，尤其CHA組，最高破斷力出現在0.15%，達252.30 g，增加幅度在62.62%以上。而OCHA組凝膠破斷力在質量分數為0.30%時最高，約為217.01 g。CA組中凝膠破斷力呈現劑量反向效應，在0.15%時最高，0.45%時顯著下降(p<0.05)。OCA組則在0.30%時破斷力最高(p<0.05)，0.45%的添加量無顯著效應(p>0.05)。多酚添加組的凝膠破斷距離改善不顯著，只有質量分數為0.15%CHA、0.30%OCHA、0.15%CA和0.30%OCA組破斷距離有輕微提高。研究結果表明，綠原酸、咖啡酸和氧化綠原酸、氧化咖啡酸皆可顯著提高馬鮫魚魚糜的凝膠破斷力，但對于破斷距離作用不顯著。

圖1 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠破斷離和凹陷度的作用Fig.1 Effects of phenolic compounds on breaking force andbreaking distance of mackerel surimi gels注：不同字母表示不同差異水平(p<0.05)(下同)。

PRIGENT等[17]認為多酚物質可以與蛋白質發生共價和非共價相互作用。低濃度的多酚存在時，蛋白質可能與多酚以非共價鍵的形式相互作用，促使肌原纖維蛋白展開結構，利于加熱時的蛋白間交聯，使凝膠強度增強[18]。同時，多酚類物質富含羥基，該基團可與蛋白形成大量的氫鍵和疏水作用，該類非共價作用對增強蛋白的凝膠性能亦有所貢獻[6]。本文中CHA與CA可能主要通過此二類作用實現馬鮫魚魚糜凝膠特性的增強。另一方面，酚類化合物在堿性環境下氧化，可以形成醌類化合物[19]，后者可以促進蛋白間的共價交聯，包括二硫鍵、碳硫鍵等，也可增強蛋白質凝膠特性[20]。本研究中的OCHA和OCA可能通過此類方式使魚糜凝膠性能提升。然而，隨酚類化合物濃度的升高，酚類化合物會發生自我交聯，從而阻礙蛋白質間的相互交聯能力，導致凝膠強度下降[21]。OCHA和OCA組中添加量為0.45%(質量分數)較添加量0.3%(質量分數)凝膠破斷力的顯著下降證實了這種推斷。可見高濃度的氧化多酚會降低其與蛋白的相互作用效率，類似的結果在乳蛋白與高濃度多酚作用中有所發現[22]。

2.2 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠顏色的影響

由表1可知，與空白組相比多酚的加入顯著降低了馬鮫魚魚糜凝膠的白度(p<0.05)，且隨著添加濃度的上升，白度下降越顯著。其中氧化咖啡酸的魚糜凝膠白度下降最顯著，添加其他幾種多酚的魚糜凝膠顏色尚可接受。這可能是由于OCA在其氧化過程中，形成不穩定物質，導致顏色變深，從而使魚糜凝膠白度降低。多酚類物質具有較多羥基結構，一般帶有顏色[3]，在pH值呈堿性下，顏色會加深。本研究中，為了更好地溶解多酚并促進氧化，pH值被調節至8.0左右，因此魚糜凝膠的顏色產生一定影響。BALANGE等在大眼鯛魚魚糜[10]和羽鰓鮐魚魚糜中[12]也發現單寧酸、綠原酸、阿魏酸的使用降低了2種魚糜凝膠白度，類似的結果在O’CONNELL的研究中也發現多酚的添加對干酪制品的顏色產生影響[23]。以上結果表明，多酚的加入對馬鮫魚魚糜凝膠顏色性質產生顯著影響，但在較低使用濃度下顏色改變可以控制在可接受水平。

表1 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠白度的影響Table 1 Effects of phenolic compounds on color properties of mackerel surimi gels

續表1

多酚質量分數/%L*a*b*ΔE*0.1577.45±0.41b-0.76±0.07f2.71±0.33f77.27±0.43bCA0.3076.61±0.98bc-0.70±0.12f2.22±0.50f76.48±0.95bc0.4577.55±0.57b-0.29±0.07e2.57±0.06f77.40±0.56b0.1575.82±0.77c0.97±0.05c4.39±0.24cde75.41±0.78cOCA0.3074.40±0.51d2.07±0.09b6.02±0.52b73.62±0.54d0.4573.14±0.66e2.71±0.22a7.17±0.35a72.06±0.65e

注：不同字母表示處于不同顯著差異水平。

2.3 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠持水性(WHC)的影響

不同質量分數多酚處理的馬鮫魚魚糜凝膠WHC變化如圖2所示。

圖2 多酚質量分數對馬鮫魚魚糜凝膠WHC的影響Fig.2 Effects of phenolic compounds on WHC ofmackerel surimi gels

與對照組相比，0.15%CHA組和0.30%OCHA組WHC顯著上升，且后者高于前者(p<0.05)。其他幾組呈現一定上升但不顯著，而0.45%CHA組WHC與對照組無差異(p>0.05)。呈現最高WHC的CHA和OCHA添加組濃度與凝膠破斷力的結果一致，而這主要源于綠原酸的次級作用力的增強和氧化綠原酸對應醌類物質對于肌原纖維蛋白的共價交聯作用。結果表明，綠原酸通過非共價作用力形成的蛋白凝膠結構對保水性能的提升效果弱于氧化氯原酸形成的共價作用力效果。CA與OCA組WHC較對照組均有上升(p<0.05)，其中CA在添加量為0.15%時WHC最高，提高接近93.21%，繼續提高質量分數，WHC反而下降。添加量為0.15% OCA組WHC較對照組顯著上升(p<0.05)，但不同濃度組間無顯著差異(p>0.05)。CA組WHC變化與其凝膠破斷力變化一致，表明CA的添加可能促使蛋白發生了結構改變，利于更強烈的蛋白相互作用，提高凝膠保水性能，尤其是低濃度的CA效應最為顯著。然而OCA組WHC變化趨勢與其凝膠破斷力變化趨勢不同。可能由于肌原纖維蛋白隨著氧化酚酸質量分數升高，發生了過氧化現象，導致蛋白質之間過度交聯，肌原纖維蛋白之間內部網絡結構破壞，束縛水的能力下降，WHC因此減弱。但此時過度交聯沒有降低凝膠強度，可能會使凝膠更硬，不利于魚糜制品口感，類似結果在WANG等[24]的研究中有過報道。以上結果表明，綠原酸、咖啡酸及他們的氧化形式在適宜質量分數下均可提升馬鮫魚魚糜凝膠的保水性能。

2.4 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠弛豫時間的影響

如圖3所示，T2出現了3個類型的峰：T21峰(0～10 ms)、T22峰(60～200 ms)、T23峰(>600 ms)。

圖3 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠弛豫時間T2分布的影響Fig.3 Effects of phenolic compounds on T2 relaxation timedistribution of mackerel surimi gels

根據SANCHEZ-ALONSO等[25]報道，低場核磁共振中的弛豫時間T2反映的是體系中水分子的自由度，包括T21、T22、T23，且分別代表著結合水、吸附水、自由水。與對照組的馬鮫魚魚糜凝膠相比，隨著多酚濃度的升高T2峰值發生不同程度的偏移。CHA與OCHA均向左發生偏移，且CHA組和0.45%OCHA的峰都在增大(p<0.05)，0.45%CHA的峰最高， 0.15%OCHA和0.30%OCHA的峰略有減小(p<0.05)。CA與OCA也均向左發生偏移，與對照組相比所有的峰都在增大(p<0.05)， 0.45%CA的峰值最高， 0.30%OCA的峰值增加最少。ZHANG等[26]研究發現，適宜溫度處理魚糜凝膠后，其T22的弛豫時間左移、增加，吸附水也增加，此現象說明部分自由水在轉化為吸附水，水與凝膠網絡間的相互作用增強，魚糜凝膠束縛水的能力增強。以上結果表明在CHA, OCHA, CA和OCA的作用下，凝膠的保水能力在增強，這與2.3中結果相一致。但是并不是所有的多酚添加組WHC都與各自T22峰值相對應，這可能由于實驗本身誤差導致。

2.5 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠微觀結構的影響

凝膠強度較對照組有所提升的馬鮫魚魚糜凝膠微觀結構電鏡觀察結果如圖4所示。

圖4 多酚對馬鮫魚魚糜凝膠微觀結構的影響Fig.4 Effects of phenolic compounds on microstructureof mackerel surimi gels

對照組(圖4-E)凝膠微觀結構比較松散，孔隙較大且不均勻，添加了綠原酸、咖啡酸和二者氧化形式的馬鮫魚魚糜凝膠網狀結構變得緊實致密，孔洞相對均勻、微小，尤其是0.15%CHA組和0.30%OCA組。呂宏宇等[27]在氧化多酚作用于鯽魚魚糜的研究中也發現，凝膠結構在添加適當濃度的多酚后變得均勻，孔徑更小，更致密，同時凝膠性能增強，而BALANGE[12]在羽鰓鮐魚魚糜研究中也發現氧化單寧酸、氧化阿魏酸和氧化茶多酚增強了凝膠強度，且增強組凝膠形成的孔洞更均勻致密。此外，BUMARD等[11]也報道沙丁魚魚糜在添加富含多酚的椰果殼提取物后形成的凝膠較對照組明顯的更致密、空洞更小。可見，多酚可與肌原纖維蛋白發生共價與非共價鍵作用，改變其凝膠微觀構造，網絡結構致密，抵抗外壓能力增強，凝膠強度提高。

3 結論

在適宜濃度的綠原酸、咖啡酸和氧化氯原酸、氧化咖啡酸均可提升馬鮫魚魚糜凝膠特性。綠原酸和咖啡酸主要通過非共價作用力促進馬鮫魚魚糜肌原纖維蛋白之間作用，而氧化綠原酸和氧化咖啡酸主要通過共價交聯促進肌原纖維蛋白網絡結構的改善，形成更多致密均勻孔洞，提高凝膠強度和保水能力。二者的使用對魚糜凝膠白度有一定影響，低濃度使用造成的顏色變化可以接受。