動態高壓微射流協同糖基化處理對β-乳球蛋白熱穩定性和結構的影響

謝雅雯,涂宗財,*,張露,王振興,楊萍,邵艷紅,沙小梅,王輝

1(江西師范大學 生命科學學院,功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌，330022) 2(南昌大學,食品與科學技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

蛋白質作為食品中的重要組成成分，具有較高的營養特性[1]。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)作為乳清蛋白中一種重要的組成部分，約占44%～50%，是一種球形蛋白。它具有結合視黃醇、VE、甾醇類化合物及部分脂肪酸等生理功能，并且擁有極佳的氨基酸比例和豐富的必需氨基酸[2]。但是其變性溫度較低則限制了在食品工業中的應用，因此增大β-Lg的熱變性溫度則尤為迫切和必要。

目前，對食品蛋白進行改性以提高其加工性能或功能活性已成為食品工業領域的研究熱點之一，蛋白質常用的改性方法包括多種，例如酶解法，物理方法和化學方法等。近年來，針對于蛋白質改性的研究逐漸增多，特別是非熱加工技術(如高壓、超聲波、脈沖電場、微波、動態高壓微射流等)結合糖基化反應的復合方法越來越廣泛地應用于蛋白質改性，以提高蛋白質的功能性質。例如OBOROCEANU等[3]發現脈沖電場能有效促進乳清分離蛋白和葡聚糖的羰氨反應，提高乳清分離蛋白的溶解性和乳化特性；BU等[4]研究了溫度變化對于β-Lg抗原性的影響，發現當溫度變化為50～90 ℃時，其抗原性也逐漸升高，當溫度大于90 ℃時，其抗原性顯著下降。ZHONG等[5]采用動態高壓微射流與糖基化反應對β-Lg進行復合修飾，發現這種復合改性方法能改變β-Lg的空間結構，導致β-Lg的免疫特性發生變化。

動態高壓微射流(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是一種特殊形式的超高壓均質技術，是以超高壓理論、流體力學理論、撞擊流理論為基礎，集輸送、混合、粉碎、加壓等多種單元操作于一體的新興高壓加工技術[6]。前期研究發現，DHPM協同半乳糖糖基化改性能有效提升β-Lg的乳化性，降低其致敏性、表面疏水性和內源熒光強度，使其α-螺旋含量升高，β-折疊含量降低[7]。但目前關于DHPM協同多糖糖基化改性β-Lg的研究還少見報道。因此，本實驗以多糖(葡聚糖)和β-Lg為研究對象，研究DHPM協同多糖糖基化處理對β-乳球蛋白的熱穩定性和結構的影響，同時分析DHPM預處理對β-Lg-葡聚糖糖基化程度的影響，為加工改性β-Lg在食品工業中的應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

β-乳球蛋白、葡聚糖，美國Sigma公司；其他所需試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

微射流均質機(M-7125型 Microfluidics型)，美國Microfluidics公司；熒光光譜儀(F-7000型)，日本日立公司；紫外可見分光光度計(U-2910型)，日本日立公司；圓二色譜儀(MOS-450型)，法國Bio-Logic SAS公司；酶標分析儀(SynergyH1型)，美國Bio Tek公司；DSC差示量熱掃描儀(F3-200型)，德國耐馳儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DHPM處理

將β-Lg溶于pH 8.0，0.01 mol/L的PBS溶液中，采用DHPM分別在不同壓力下(0、40、80、120 MPa)對β-Lg溶液處理3次，再與葡聚糖按1∶1的質量比混合，冷凍干燥后-20℃儲藏備用。最終得到的樣品分別表示為β-LgX(代表經DHPM預處理的β-Lg體系，X分別為0、40、80、120 MPa，下同)和β-LgDX(經DHPM預處理的β-Lg葡聚糖體系)。

1.2.2 糖基化反應

稱取等量的β-Lg、β-LgDX樣品置于裝有飽和KI溶液的帶蓋玻璃樣品瓶中，烘箱中55 ℃下干熱反應10 h，烘箱中的環境濕度穩定在65%，糖基化反應10 h結束后將離心管置于冰水中終止反應，最后于-20 ℃冰箱內儲藏，待測。

1.2.3 熱穩定性的測定

采用差示掃描量熱儀測量β-Lg糖基化產物的熱變性溫度[8]。精確稱取6.0 mg樣品于樣品鋁盒中，掃描速度為10 ℃/min，掃描溫度為30～120 ℃。空盤作參比，得DSC掃描曲線。

1.2.4 游離氨基含量的測定

采用鄰苯二甲醛法測定樣品中自由氨基的含量[9-10]。取100 μL樣品與2 mL OPA試劑(含0.8 g/L OPA、20 g/L SDS、38 g/L硼砂、2 g/L β-巰基乙醇)于試管中混勻，37 ℃溫浴反應2 min后于340 nm處測量吸光度，用同體積蒸餾水代替實驗對照組。以賴氨酸(0～0.1 mg/mL)為標品繪制標準曲線，計算樣品中游離氨基的含量(mg/mL)。

1.2.5 褐變程度的測定

取DHPM協同糖基化處理后的樣品溶解成2 mg/mL蛋白溶液濃度，再采用酶標儀測定溶液在294和420 nm處的吸光度[11]。

1.2.6 表面疏水性(H0)的測定

采用ANS熒光探針法測定不同條件處理后的β-Lg表面疏水性的變化。取4 mL 0.1～1 mg/mL蛋白樣品與20 μL 8 mmol/L ANS溶液(0.01 mol/L，pH 8.0)混合，然后測定其熒光強度。測定條件：發射光譜波長范圍為400～600 nm，激發光譜波長為370 nm，發射和激發的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓為400 V。以蛋白質量濃度(mg/mL)為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，對曲線采用線性回歸分析進行擬合，曲線斜率的計算結果則為蛋白樣品的表面疏水性(H0)[12]。

1.2.7 自由巰基含量的測定

采用ELLMAN的試劑分析方法測定不同條件處理后的β-Lg自由巰基含量[13]。將DHPM協同糖基化處理后的樣品配成1 mg/mL蛋白溶液，之后取250 μL樣品與500 μL 0.01 mol/L的DTNB混勻(0.1 mol/L，pH 8.0磷酸鹽緩沖液配制)，37 ℃反應20 min后于412 nm處測吸光值。自由巰基的計算見公式(1)：

(1)

式中：A412，412 nm處的吸光度;D，稀釋倍數;C，樣品質量濃度(mg/mL)。

1.2.8 圓二色譜(circular dichroism，CD)分析

根據CHEN等[14]的方法對不同條件處理后的β-Lg和β-LgD體系進行CD分析。將凍干后的樣品用蒸餾水配制成0.1 mg/mL，然后采用光路長為0.1 cm的圓形石英比色皿進行遠紫外CD分析。掃描范圍為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，譜帶寬度為1.0 nm，環境溫度為22 ℃，每個樣品測3次，測量值以橢圓率([θ], degree·cm2/dmol)表示，具體的二級結構含量使用在線分析軟件(DichroWeb)分析，網址為：http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml。

1.2.9 內源熒光強度的測定

用F-7000型熒光光譜儀測定各個條件處理下β-Lg熒光強度的變化。參照LUCIA等[15]的方法，測定條件：發射光譜波長范圍為300～450 nm，激發光譜波長為280 nm，發射和激發的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min，電壓為400 V。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次，結果用平均值±標準偏差表示，所得實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析(p<0.05)，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 熱穩定性分析

差示掃描量熱法是在程序自動的升溫、恒溫或降溫階段下，測定樣品和參照物之間溫度與熱量差的關系，對于物質熱變性的研究已經較為廣泛[16]。常用測量曲線中峰頂的溫度作為樣品變性溫度，變性溫度越大熱穩定性越大，變性溫度越小說明其熱穩定性越小。由圖1-A可知，經DHPM預處理后，樣品的峰形發生較大的變化，熱峰的高度先是降低，隨著處理壓力的進一步增大，β-Lg的熱峰高度也慢慢回升，壓力越大，峰形也越大；β-Lg的熱變性溫度也隨處理壓力的增大呈先降低后升高的趨勢，由天然β-Lg的73.48 ℃先降至66.66 ℃后升高至78.96 ℃，這與DHPM對乳清蛋白[17]和花生蛋白[18]的影響趨勢較為相似。以上結果說明了，40 MPa的動態高壓微射流技術降低了β-Lg的熱穩定性，同時也降低了變性所需要的能量，而隨著壓力增大，其熱穩定性又逐漸升高，變性所需要的能量也逐漸增大。因此，DHPM處理后的β-Lg處于一個更不穩定的狀態，可能是因為有部分相互作用力遭到破壞，β-Lg分子發生了部分變性。

通過比較圖1-A和圖1-B可知，糖基化后β-Lg的熱穩定性明顯提升，β-LgD和β-Lg的熱變性溫度分別為77.28 ℃和73.48 ℃，DHPM 80 MPa預處理的糖基化β-Lg具有最高的變性溫度，達82.37 ℃；而β-LgD40和β-LgD120的熱變性溫度低于80 MPa預處理樣品的熱變性溫度，但仍高于未處理的β-Lg以及DHPM處理下的β-Lg最高(78.96 ℃)的熱變性溫度，這表明糖基化反應能顯著提升β-Lg的熱穩定性。CHEVALIER 等[19]報道， β-Lg與不同的糖發生糖基化反應會誘導β-Lg構象發生變化，β-Lg的變性溫度升高。CHEN等[20]研究表明β-Lg與還原糖發生糖基化反應后β-Lg的變性溫度要高于未發生糖基化反應的β-Lg。這可能是因為一般情況下，一個三維蛋白質的獨特結構是由非共價相互作用中的各種吸引力和推斥力以及少數的二硫鍵所組成，而變性就需要破壞這些相互作用，糖基化后蛋白質的構象發生了變化，變性所需要的相互作用力也就變得更大。

圖1 DHPM不同壓力預處理對β-Lg(A)和β-Lg-葡聚糖體系(B)熱穩定性的影響Fig.1 Effect of DHPM pre-treatment at various pressureson the thermal stability of β-Lg(A) and β-Lg-dextran system(B)

2.2 游離氨基含量分析

糖基化反應是蛋白質的氨基與碳水化合物的羰基通過共價鍵相互交聯形成糖蛋白的化學反應，常用游離氨基含量的變化來表示蛋白質與糖接枝反應的程度。由圖2可知，天然β-Lg的游離氨基含量隨著DHPM預處理壓力的增大呈先減小后增加的趨勢，并且在80 MPa時達到最低，為2.55 mg/mL。

圖2 DHPM不同壓力預處理對β-Lg-葡聚糖體系游離氨基含量的影響Fig.2 Effects of DHPM pre-treatment at various pressureson the content of free amino groups of β-Lg-dextran system

經過DHPM協同糖基化處理后，β-Lg糖基化產物的游離氨基含量明顯低于未糖基化的β-Lg，β-LgD的游離氨基含量為為2.69 mg/mL，而β-Lg則為2.89 mg/mL；且其含量隨著處理壓力的增大呈先下降后升高的趨勢，并且在80 MPa時達到最低，為2.29 mg/mL，說明DHPM預處理能夠促進β-Lg的糖基化反應。這可能是因為DHPM處理使β-Lg去折疊，同時誘導蛋白質的構象發生變化，使β-Lg的結構達到不同程度的展開，結構變得更為分散，更多的賴氨酸(Lys)殘基暴露到分子表面與糖的醛基共價交聯，發生羰氨縮合反應[21-23]。當DHPM壓力為120 MPa時，游離氨基含量又略有增加，為2.31 mg/mL，可能是因為蛋白質再度發生聚集。

2.3 褐變程度分析

糖基化反應產物的吸光度通常被用來描述糖基化進程，糖基化反應中初級產物的形成量可以用294 nm處的吸光度來評價；而反應的終極產物的形成量則可以用420 nm處的吸光度來評價[24]。DHPM處理和DHPM預處理協同糖基化反應對β-Lg的褐變程度的影響如圖3所示。

A-294 nm處吸光值；B-420 nm處吸光值圖3 DHPM不同壓力預處理對β-Lg-葡聚糖體系的褐變程度的影響Fig.3 Effect of DHPM pre-treatment at various pressures onthe browning intensity of β-Lg-dextran system

樣品在294 nm處的吸光度與420 nm處的吸光度變化趨勢大致相同。DHPM預處理協同糖基化的β-Lg產物在294 nm和420 nm的吸光度明顯高于DHPM處理的β-Lg。當DHPM單獨進行處理時，β-Lg在294 nm處的吸光值變化較小，在420 nm處的褐變程度變化趨勢隨著DHPM壓力的增大呈先增大后減少趨勢，在80 MPa時達到最大。

DHPM協同糖基化處理時，40 MPa預處理結合糖基化的β-Lg的褐變程度與0 MPa時的糖基化產物的褐變程度明顯增加，294 nm和420 nm處的吸光值分別由0.80和0.048升高到1.00和0.056；當處理壓力為80 MPa時，294 nm和420 nm處的吸光度分別為1.09和0.062，說明80 MPa的DHPM處理能夠明顯增大β-Lg的糖基化程度；而當處理壓力為120 MPa時，兩處的吸光值又稍稍降低，低于80 MPa卻仍高于40 MPa，分別為1.07和0.059。說明DHPM 80 MPa預處理對β-Lg-葡聚糖糖基化反應有最大的促進作用，因此生成的糖基化產物也最多。所以，DHPM預處理可以促進β-Lg-葡聚糖的糖基化反應，這可能是因為β-Lg經DHPM處理后其結構趨于展開狀態[25-26]，高壓誘導的去折疊態可提高蛋白質的反應活性[27]。

2.4 表面疏水性分析

蛋白質的表面疏水性(H0)作為蛋白質表面與水溶液環境接觸的疏水基團的重要參數，在蛋白質三級結構中占有主導地位，對于蛋白質結構的研究非常重要[28]。DHPM預處理結合糖基化反應對β-Lg表面疏水性的影響如圖4所示。

圖4 DHPM不同壓力對β-Lg-葡聚糖體系表面疏水性的影響Fig.4 Effects of DHPM pre-treatment at various pressureson the surface hydrophobicity in β-Lg-dextran system

由圖4可知，隨著DHPM處理壓力的逐漸增大，β-Lg的表面疏水性明顯升高，且在80 MPa處理壓力下具有最高的表面疏水性為59.11，原因可能是DHPM處理使β-Lg內部的疏水性區域外翻暴露到分子表面，與疏水性探針ANS結合，使其表面疏水性增加。同時從圖4可以看出，未經過糖基化處理的β-Lg明顯高于經過糖基化處理后的β-Lg的H0值，說明糖基化反應會改變β-Lg的空間構象，降低其表面疏水性，原因一方面可能是糖基化反應會使分子中外翻的疏水性基團包埋在其內部；另一方面是親水性的葡聚糖與蛋白質形成共價鍵導致蛋白質分子表面親水性基團的增加，從而降低了蛋白質的表面疏水性[29]。

2.5 自由巰基含量分析

巰基基團是蛋白質中很重要的功能性基團，屬于維持蛋白質三維結構的弱次級健, 能相互交聯形成二硫鍵來維持蛋白質高級結構的穩定，因此對其功能性質的發揮具有很重要的作用，屬于蛋白質中重要的功能性基團。每個β-Lg單體中都含有5個半胱氨酸殘基，2個二硫鍵(Cys 66-Cys 160、Cys 106-Cys 199)和1個自由巰基(Cys 121)，其中游離的第121位半胱氨酸是包埋在β-Lg分子內部[30]。圖5是不同條件處理對β-Lg自由巰基含量的影響。由圖5可知，天然β-Lg的自由巰基含量最低，為39.91 μmol/g，隨著DHPM壓力的增大，β-Lg中的巰基含量呈先增大后降低的趨勢，并在80 MPa時達到最大，為42.06 μmol/g。由此可知，DHPM處理會誘導β-Lg去折疊，導致其巰基含量上升，這與MONAHAN等[31]的研究結果類似。

圖5 DHPM不同壓力對β-Lg-葡聚糖體系自由巰基含量的影響Fig.5 Effects of DHPM pre-treatment at various pressureson the free sulfhydryl groups of β-Lg-dextran system

與天然和DHPM預處理β-Lg相比，DHPM協同葡聚糖糖基化處理能顯著增加β-Lg的自由巰基含量。當預處理壓力由0 MPa增加到80 MPa時，β-LgD的自由巰基含量由39.07增加到43.22 μmol/g。但預處理壓力為120 MPa時，β-LgD體系中的自由巰基含量較80 MPa有所降低，但仍高于0 MPa，為41.23 μmol/g。因此，DHPM 80 MPa預處理樣品具有最高的自由巰基含量。以上結果表明，DHPM協同糖基化處理能引起β-Lg蛋白質分子不斷“溶脹”發生去折疊，導致蛋白質分子內部的巰基基團不斷暴露，內部的二硫鍵暴露到分子表面，促使巰基含量顯著上升。

2.6 β-Lg的二級結構分析

圓二色譜可以用來檢測β-Lg的二級結構，解析DHPM處理和糖基化反應對β-Lg二級結構的影響。DHPM處理后β-Lg的CD譜圖如圖6-A所示，二級結構組成與比例如表2所示。β-Lg是以β-折疊為主的蛋白質，由分子C端上的一個主要的α-螺旋和9條反平行的β-折疊構成[32]，這與表中數據相符。由表2可以看出，DHPM處理對β-Lg二級結構的各組分含量有顯著影響，其β-折疊和α-螺旋的百分含量隨DHPM壓力的增大呈先升高后降低的趨勢，并且β-轉角的百分含量均減少，無規則卷曲的百分含量均增加。當DHPM壓力為40 MPa時，β-折疊含量達到最大，為35.0%，但當處理強度進一步增大時，β-折疊含量開始下降，無規則卷曲增加。由于蛋白質的二級結構不僅取決于其氨基酸序列，還與蛋白質不同基團之間的相互作用力有關，如氫鍵、靜電相互作用、范德華力[33]，因此DHPM處理會改變β-Lg二級結構，并且β-折疊與無規則卷曲相互轉化。

圖6 DHPM協同糖基化處理后β-Lg(A)和β-Lg-葡聚糖體系(B)的CD譜圖Fig.6 CD spectra of β-Lg(A) and β-Lg-dextran(B)treated by DHPM pre-treatment combined with glycation

圖6-B為DHPM協同糖基化處理后的β-Lg的CD譜圖，表2中為其二級結構組成與比例。如表2所示，與天然β-Lg相比，糖基化會降低β-Lg中α-螺旋的百分含量，但DHPM協同糖基化處理后的β-折疊均高于天然β-Lg，但β-轉角和無規則卷曲的百分含量均呈現明顯降低趨勢，并均在80 MPa時達到最低，分別為21.1%和29.1%。40 MPa和120 MPa DHPM預處理結合糖基化樣品分別具有最高β-折疊百分含量(37.3%)和最低的α-螺旋百分含量(11.1%)。這說明DHPM協同糖基化處理過程β-Lg的二級結構發生顯著變化，4種結構之間會相互轉換，可能是因為當β-轉角、無規則卷曲百分含量減小時，蛋白質的結構會更加穩定，從而提高了β-Lg的熱穩定性。

表2 DHPM處理和DHPM預處理結合糖基化對β-Lg-葡聚糖二級結構的影響Table 2 Effect of DHPM treatment and DHPM pre-treatment combined with glycation on the secondary structure of β-Lg

2.7 內源性熒光分析

內源熒光強度通常被用來檢驗蛋白質分子的3級結構。分子中具有3種熒光特性基團，分別為色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，β-Lg的內源熒光主要來源于色氨酸殘基(Trp 19和Trp 61)，因其對于微環境細微變化十分敏感，所以可以用Trp殘基作為β-Lg的內源熒光探針來分析蛋白質構象的變化[34-35]。由圖7-A可看出，經過DHPM單獨處理后的β-Lg熒光強度增大，且隨著DHPM壓力的增大而逐漸增大。

DHPM不同壓力預處理對β-LgD體系的內源熒光強度光譜圖的影響如圖7-B所示。由圖7-B可知，天然β-Lg的內源熒光強度為5 075，經糖基化反應后β-Lg的熒光強度明顯下降；而經DHPM預處理協同糖基化反應后，β-Lg的內源性熒光強度隨DHPM壓力的增加先減少而后增加，且最大吸收峰處的波長發生了3 nm以上的紅移，80 MPa預處理的β-LgD反應產物的內源熒光強度最低，僅為3 764，為未處理樣品的74%。這可能是由于糖基化反應改變了β-Lg的結構，Trp 19和Trp 61暴露到親水環境中引起熒光猝滅，并且這種復合處理迫使β-Lg結構展開，從而引起內源性熒光光譜最大吸收峰處的波長發生紅移[36]。然而，隨著DHPM壓力的進一步增大，蛋白發生折疊，迫使β-Lg蛋白的Trp 19和Trp 61殘基再次埋到蛋白質結構內部，導致120 MPa時的熒光強度再度增加。

圖7 DHPM處理(A)和DHPM預處理結合糖基化(B)對β-乳球蛋白內源熒光光譜的影響Fig.7 Effect of DHPM treatment(A) and DHPM pre-treatment combined with glycation(B) on the intrinsicfluorescence of β-Lg

3 結論

(1)DHPM預處理協同糖基化反應可提高β-Lg的熱穩定性，當壓力為80 MPa時達到最大。糖基化反應后，β-Lg的游離氨基含量明顯降低，褐變程度明顯升高；隨著DHPM處理壓力的增大，β-Lg-葡聚糖反應體系的游離氨基含量和褐變度分別呈先減少后增加和先增大而后減小的趨勢，且分別在80 MPa具有最低值和最高值。說明糖基化程度隨著DHPM預處理的壓力變化而變化，DHPM 80 MPa預處理時樣品的糖基化程度最高，熱穩定性最大。

(2)DHPM預處理會增加β-Lg的H0，80 MPa處理樣品具有最高的H0，而糖基化反應會大大降低其H0；DHPM預處理使β-Lg的自由巰基含量升高，糖基化可再次提高其自由巰基含量，并且在80 MPa時達到了最大；圓二色譜分析證明β-Lg的二級結構發生了變化；內源熒光則表明了β-Lg的三級結構發生了變化，其強度隨著壓力增大呈先降低后升高的趨勢，并且120 MPa時與40 MPa時的內源熒光強度無大致變化，說明隨著壓力增大，蛋白質再度發生聚集。同時內源熒光強度與糖基化程度的變化趨勢相反。

綜上，DHPM預處理結合葡聚糖糖基化反應能改變β-Lg的結構，增大其熱穩定性，DHPM 80 MPa預處理樣品具有高的糖基化程度和熱穩定性，為提高β-Lg熱穩定性的最佳處理壓力。