β-氨基丁酸處理對采后草莓果實貯藏品質和內部還原勢的影響

伍冬志，費良航，廖云霞，陳偲，汪開拓*

1(重慶三峽學院 環境與化學工程學院，重慶，404000) 2(重慶三峽學院 生命科學與工程學院，重慶，404000) 3(南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)

草莓(FragariaananassaDuch.)為最重要的全球性大宗水果之一，產銷需求旺盛。但采后草莓果實蒸騰作用和呼吸強度旺盛，貯藏期間失水較為嚴重，品質劣變迅速；同時，果實無外皮保護，內部組織嬌嫩多汁，故極易遭受病原菌的侵染而發生腐爛。低溫貯藏是延長草莓果實貨架期的有效方法，但由于采后草莓果實主要致病菌——灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的孢子可在較低的溫度下(-1～5 ℃)存活并萌發，因此單純的低溫貯藏不能從根本上抑制果實灰霉病的發生[1]。常規的化學殺菌劑如特克多、波爾多液和咪唑霉處理可有效抑制果實采后病害的發展，但長期施用會對農業生產環境及食品安全造成嚴重的不利影響[2]。通過綠色激發子處理來誘導果實自身抗病性可有效抑制病原菌侵染，顯著降低化學藥劑使用量，故日益受到食品或農業從業者的關注[3]。

從誘導抗病的角度來說，內部還原勢的狀態直接關聯植物誘導抗病性：抗性激發子或病原菌可直接誘導植物內部還原性信號分子、還原型谷胱甘肽(GSH)和輔酶II(NADPH)等還原性小分子物質的大量生成，從而使植物細胞核中還原勢顯著提升，最終作用于大量可調控誘導病程相關(pathogensis-related proteins，PRs)基因的轉錄因子，釋出大量具有轉錄活性的單體物質，從而啟動一系列防衛反應[4]。我們先期研究也發現，經水楊酸(SA)類似物苯丙噻唑硫代乙酸甲酯(BTH)處理的葡萄果實中還原性物質含量顯著增加，同時病程相關基因非表達子基因(Nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)表達量也急劇上升，故可推測還原勢的上升與抗病性反應存在直接關系[5]。BABA是一種小分子非蛋白類氨基酸，可直接作為信號分子來誘導櫻桃[6]、草莓[7]、葡萄[8]和水蜜桃[9]等多種果實活性氧迸發、抗病相關物質合成和PRs基因表達等抗病性反應，從而降低貯藏期間果實腐爛率。6-AN(6-氨基煙酰胺)是磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)抑制劑，可顯著抑制NADPH的生成[10]。本研究在先期成果的基礎上，分析了BABA和6-AN處理對草莓果實品質參數、還原性信號分子生成量、磷酸戊糖途徑關鍵酶活性、還原性物質積累以及PRs基因表達的影響，以期明確還原勢對果實誘導抗性的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大小一致、轉色均勻的八分熟草莓果實(品種“豐香”)采摘于重慶市潼南區雙江鎮有機草莓種植基地，采后即刻運回實驗室，剔除存有機械傷和病蟲害果實，平鋪于操作臺上用20 ℃強制冷風吹去田間熱。

β-氨基丁酸(BABA),美國Sigma公司；6-氨基煙酰胺(6-AN),上海aladdin試劑公司；谷胱甘肽還原酶(GR),上海源葉生物科技有限公司；NO檢測試劑盒、NADP+/NADPH檢測試劑盒、GSH/GSSG檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；Tripure Isolation Reagent試劑盒、SuperScript II試劑盒,美國Invitrogen公司。

PAL-1型數顯糖度計,日本Atago公司；E-201C型酸度計,上海雷磁公司；DW-86L338J型超低溫冰箱,海爾公司；UV2600i紫外可見分光光度計,日本島津公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司；BSC-150恒溫恒濕培養箱,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；DYCP-31D型核酸電泳儀,北京六一儀器廠；PTC-200型RT-PCR儀器、Gel Doc XR型凝膠成像儀,Bio-Rad公司。

1.2 處理

我們先期研究證實，10 mmol/L BABA處理可顯著誘導草莓果實抗病性反應，從而顯著抑制果實在低溫或常溫貯藏期間灰霉病的發生[7]。因而，本研究以此BABA濃度為基礎開展后續研究。

草莓果實經70 %酒精仔細擦拭表面后隨機分為4組：(1)對照組，果實不經任何處理；(2)BABA處理組，用10 mmol/L BABA溶液對果實進行噴灑處理，在此過程中，不斷旋轉果實以使噴灑均勻，隨后強制風吹干；(3)6-AN處理組，用5 mmol/L 6-AN對果實進行噴灑處理，隨后強制風吹干；(4)BABA+6-AN處理組，先用10 mmol/L BABA溶液對果實進行噴灑處理，強制風吹干后再用5 mmol/L 6-AN對果實進行噴灑處理。操作溫度均保持在(20±1) ℃。處理結束后，將草莓果實分裝于聚乙烯塑料盒中，在(20±1) ℃、80%～90% RH的培養箱中貯藏5 d。在貯藏期間每天觀察草莓果實發病情況，并切取健康果肉組織在液氮中速凍，最后于-80 ℃超低溫冰箱中存放備檢。每個處理不少于200顆果實，各處理均重復3次，整個實驗重復2次。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 發病率

當果實表面出現明顯霉菌斑點時即記錄為病果。

(1)

1.3.2 品質參數測定

切取健康草莓果肉用榨汁機榨取果汁后進行測定。用數顯糖度計直接測定果汁中可溶性固形物含量；用0.01 mol/L NaOH溶液直接將10 mL果汁滴定至pH 8.2，根據消耗量來計算可滴定酸(TA)含量；用酸度計直接測定果汁pH值[11]。

1.3.3 抗氧化活性、總花色苷和酚類含量測定

取5 g果肉凍樣用50 mL冷丙酮勻漿，再以 5 000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定相關指標。采用pH示差法[12]測定果實總花色苷含量，用Flion-Ciocalteu法[13]測定總酚含量。參考SHE等[14]方法測定DPPH自由基清除率和總還原力，總還原力以700 nm吸光值進行表示。

1.3.4 水楊酸(SA)和一氧化氮(NO)含量的測定

參考龔波林[15]的方法，利用水楊酸的溴代反應生成的2,7-二氯熒光素-Br2-水楊酸反應物，通過熒光法測定果實痕量SA含量；NO含量的測定參考MURPHY和NOACK[16]的方法，以高鐵血紅蛋白法進行測定。

1.3.5 NADPH和NADP+以及GSH和GSSG含量的測定

NADPH和NADP+參考NAGANO等[17]的硫酸甲酯吩嗪反應法進行測定；GSH和GSSG參考RAHMAN等[18]的酶循環法，利用與5,5′-二硫硝基苯甲酸的反應來進行測定。

1.3.6 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)活性的測定

稱取2 g果實凍樣， 加入10 mL內含30 mmol/L甘露醇、5 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl和1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)仔細勻漿，再以5 000×g離心10 min(4 ℃)后取上清液測定酶活性。G6PDH和6PGDH活性參照INDEL等[19]的方法進行測定，略有改進。3 mL G6PDH反應體系中包含0.8 mL粗酶液、1.1 mL 10 mmol/L NADP+溶液和1.1 mL 10 mmol/L 6-磷酸葡萄糖溶液；3 mL 6PGDH反應體系中包含1.0 mL粗酶液、0.7 mL 10 mmol/L NADP+溶液、0.7 mL 10 mmol/L 6-磷酸葡萄糖酸溶液和0.6 mL提取緩沖液。反應液中每分鐘生成1 nmol NADPH為1個酶活力單位，以U/mg蛋白表示結果。用考馬斯亮藍比色法測定提取液中蛋白質含量[20]。

1.3.7PRs基因表達豐度的測定

取1 g果實凍樣使用Tripure Isolation Reagent試劑盒提取RNA。取1 mg RNA采取SuperScript II試劑盒逆轉錄cDNA第一鏈，Oligo(dT)為引物。用Primer Premier 7.0軟件設計相關基因特異性引物(表1)。以草莓18S rRNA基因為內參。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB染色后用凝膠成像儀掃描并定量分析[21]。

表1 草莓PRs基因特異性引物序列Table 1 Sequence of primers used for PRs genes in strawberries

1.4 數據分析

果實發病率重復測定5次，其余指標均重復測定3次。采取Duncan多重比較法(SPSS 13.0)進行差異顯著性檢驗，5%和1%記錄為顯著和極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間發病率、品質參數和抗氧化活性的影響

如圖1所示，草莓果實在貯藏期間果實病害發生率逐漸上升。

圖1 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間發病率的影響Fig.1 The effects of BABA and 6-AN treatments on diseaseincidence on strawberries during 5 days of storage

對照果實在貯藏5 d后，其發病率達到31.1%；BABA處理可顯著(p<0.05)抑制果實貯藏期間發病率的上升，經BABA處理的果實在貯藏結束時發病率較對照水平下降了51.6%。單一6-AN處理或BABA+6-AN復合處理則均加劇了果實病害的發生，果實發病率在貯藏結束時分別較對照水平上升了34.2%和22.1%。

同時，草莓果實經10 mmol/L BABA處理后，其TSS、總花色苷和總酚含量以及DPPH自由基清除率和總還原力均顯著(p<0.05)高于對照組水平；TA含量和pH值則與對照果實相比無顯著差異。單一6-AN和BABA+6-AN復合處理顯著降低了果實各項品質指標和抗氧化活性，至貯藏5 d后，除pH值外，果實中其他各品質指標數值以及DPPH自由基清除率和總還原力均顯著(p<0.05)低于對照組水平(表2)。

2.2 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間NO和SA含量的影響

如圖2所示，對照草莓果實NO含量在整個貯藏期間基本維持穩定，而SA含量則隨貯藏時間的延長而逐漸下降；經BABA處理的果實中NO含量在貯藏1 d后明顯上升，并在隨后貯藏時期內均顯著(p<0.05)高于對照果實，同時BABA處理也顯著延緩了果實SA含量的下降，使SA含量在整個貯藏期間均顯著(p<0.05)高于對照果實。單一6-AN處理及BABA+6-AN處理均抑制了草莓果實中NO和SA生成量，經6-AN處理的果實中NO和SA含量在整個貯藏周期均顯著(p<0.05)低于對照果實。

2.3 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間NADPH和NADP+含量的影響

表2 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏5 d后品質參數和抗氧化活性的影響Table 2 The effects of BABA and 6-AN treatments on quality parameters and antioxidant activities instrawberries after 5 days of the storage

注：各列數據存有不同字母即存有差異性顯著(p<0.05)。

圖2 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間NO(A)和SA(B)含量的影響Fig.2 The effects of BABA and 6-AN treatments oncontents of NO (A) and SA(B) in strawberries during5 days of storage

如圖3所示，在20 ℃ 貯藏期間，對照草莓果實中NADPH含量在貯藏前2 d逐漸上升，隨后緩慢下降；GSSG含量則基本維持穩定。10 mmol/L BABA可促進果實NADPH生成，并降低NADP+的積累。經6-AN或BABA+6-AN處理的果實中NADPH含量在整個貯藏期間均顯著(p<0.05)低于對照果實；同時，經6-AN或BABA+6-AN處理的果實中NADP+含量則在貯藏后3 d均顯著(p<0.05)高于對照果實。單一6-AN處理較BABA+6-AN處理更為顯著(p<0.05)的提升了果實NADP+含量。

圖3 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間NADPH(A)和NADP+(B)含量的影響Fig.3 The effects of BABA and 6-AN treatments oncontents of NADPH (A) and NADP+ (B) in strawberriesduring 5 days of storage

2.4 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間GSH和GSSG含量的影響

對照草莓果實中GSH含量在貯藏期間呈緩慢下降趨勢，而GSSG含量則逐漸上升。經BABA處理的果實中GSH含量迅速上升，其含量在貯藏2 d后均顯著(p<0.05)高于對照果實；6-AN處理顯著(p<0.05)抑制了果實中GSH產生，經單一6-AN或BABA+6-AN處理的果實中GSH含量在整個貯藏期間顯著(p<0.05)低于對照果實(圖4-A)。經BABA處理的果實中GSSG含量逐漸下降，但經單一6-AN或BABA+6-AN處理的果實中GSSG含量在整個貯藏時期內均顯著(p<0.05)高于對照果實(圖4-B)。

圖4 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間GSH(A)和GSSG(B)含量的影響Fig.4 The effects of BABA and 6-AN treatments oncontents of GSH (A) and GSSG (B) in strawberries during5 days of storage

2.5 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間G6PDH和6PGDH活性的影響

在20 ℃貯藏期間，對照草莓果實中G6PDH活性逐漸降低，而6PGDH活性則緩慢上升。BABA處理有效延緩了果實G6PDH活性的下降并在貯藏2 d后誘導了6PGDH活性的上升，使2種酶活性在貯藏2 d后均顯著高(p<0.05)于對照果實。單一6-AN處理或BABA+6-AN處理顯著降低了果實中G6PDH和6PGDH活性，經6-AN處理的果實中G6PDH在整個貯藏期間顯著(p<0.05)低于對照果實，同時6PGDH活性也在貯藏2 d后顯著(p<0.05)低于對照水平(圖5)。

圖5 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間G6PDH(A)和6PGDH(B)活性的影響Fig.5 The effects of BABA and 6-AN treatments onactivities of G6PDH (A) and 6PGDH (B) in strawberriesduring 5 days of storage

2.6 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間PRs基因表達豐度的影響

如圖6所示，對照草莓果實中FaPR1、FaChi3、Faβglu和FaPAL等PRs基因表達量在整個貯藏期間均無顯著(p>0.05)變化。經BABA處理的草莓果實在整個貯藏期間PRs基因表達量均顯著(p<0.05)高于對照水平；單一6-AN處理或BABA+6-AN處理則抑制了這些PRs基因表達量的上升，使FaPR1、FaChi3和FaPAL基因表達豐度在貯藏期間均顯著(p<0.05)低于對照果實。

圖6 BABA和6-AN處理對草莓果實貯藏期間FaPR1(A)、FaChi3(B)、Faβglu(C)和FaPAL基因(D)表達豐度的影響Fig.6 The effects of BABA and 6-AN treatments on expression levels of FaPR1 (A)，FaChi3 (B)，Faβglu (C) and FaPAL (D) in strawberries during 5 days of storage

3 討論

BABA可通過信號傳導的方式顯著誘導多種果實抗病性反應[22]。我們先期研究發現，10～500 mmol/L BABA處理可有效誘導草莓[7]、葡萄[8]和水蜜桃[9]等果實活性氧迸發和抗病相關酶活性的上升，提升果實抗病性，從而抑制果實采后腐爛的發生。SA和NO是重要的傳導分子，可直接調控下游抗病基因的表達[23]。PR1基因是典型的植物抗病基因標記物[24]；PAL基因經轉錄翻譯后可合成苯丙烷類關鍵酶PAL，從而誘導植保素、酚類物質及木質素等抗病物質的合成[25]；Chi和βglu基因經轉錄翻譯后可合成細胞壁水解酶幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶，可降解真菌細胞壁[26]。在本研究中，10 mmol/L BABA處理顯著提升了草莓果實中抗性信號分子NO和SA積累量并誘導了FaPR1、FaChi3、Faβglu和FaPAL等PRs基因表達量的上升，同時經BABA處理的果實發病率也顯著降低而貯藏品質和抗氧化物質含量則明顯提高。這說明，BABA可在草莓果實內部進行有效的聯級信號傳導，促使抗性信號分子的積累，從而進一步誘導PRs基因的表達，最終抑制了果實病害的發生并維持果實品質。與此結果相類似，經BTH或茉莉酸甲酯(MeJA)處理的葡萄果實中，其NO含量也急劇上升，并伴隨著PRs基因的表達，從而降低了果實采后灰霉病[4,27]。

通常情況下，植物受到病原脅迫后，其組織內活性氧會瞬時迸發，進而使植物組織產生大量應激性還原反應，促進抗氧化酶活性以及還原性物質如NADPH、GSH和抗壞血酸含量的迅速升高，從而降低組織內氧化勢，提高還原勢；而高還原勢可將眾多與抗病相關的轉錄因子轉化為活性單體，最終誘導下游PRs基因表達[28]。對擬南芥的研究發現，經SA處理或病原菌侵染后，該模式作物組織中H2O2含量在瞬時急劇上升后迅速下降，但還原性成分如NAPDH卻大量生成，從而使細胞中氧化勢下降而還原勢上升，將活性較低的WRKYs和TGAs等轉錄因子共聚體還原為單體形式，從而啟動一系列下游防衛反應。因此，植物內部還原勢的狀態直接關聯植物誘導抗病性。SA和NO既是抗病信號傳導分子，亦作為還原性物質能直接調控植物內部還原勢[23]。另一方面，PPP途徑是在生命體中普遍存在的糖代謝支路，是戊糖分解的必經途徑，可使葡萄糖直接氧化脫氫并脫羧以提供生物合成的還原劑NADPH和核酸合成的原料核糖，因此可提高細胞還原勢并提供各種生化反應原料。G6PDH和6PGDH是該途徑的限速酶，其活性與NADPH合成量存有極高正相關性[31]。6-AN可高效阻遏PPP途徑中的電子傳遞，能專一性的抑制NADPH合成[10]。在本研究中，BABA處理可顯著提高草莓果實內源還原性信號分子NO和SA生成量以及GSH含量；同時，BABA處理也同時誘導G6PDH和6PGDH活性的提高，進而促進NADPH的合成。因此，BABA處理可有效提高草莓組織還原勢。與此相反，單一6-AN或BABA+6-AN處理則顯著降低了果實中NO、SA和GSH的含量，抑制G6PDH和6PGDH活性和NADPH的積累，而同時果實中NADP+和GSSG含量則明顯上升，這說明6-AN顯著降低了果實還原勢。伴隨著草莓果實還原勢的變化，經BABA處理的果實中PRs基因表達豐度明顯上升，果實發病率顯著降低；而經單一6-AN或BABA+6-AN處理的果實中PRs基因的表達受到明顯抑制，果實發病率急劇增加，暗示6-AN處理導致的果實還原勢降低嚴重限制了BABA誘導抗性的形成。因此，BABA誘導草莓果實抗病性的機理可解釋為：BABA處理可通過直接誘導還原性信號分子的生成，并通過調控PPP途徑關鍵酶活性以積累還原性物質，全面增強草莓果實內部還原勢，從而誘導一系列PRs基因的表達，最終提高果實抗病性并抑制了草莓果實貯藏期間腐爛的發生。

4 結論

(1)10 mmol/L BABA處理可顯著降低草莓果實貯藏期間的腐爛率并維持果實品質。

(2)10 mmol/L BABA處理可提升草莓果實還原勢，從而提高PRs基因表達豐度以形成果實抗病反應。