一種快速檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的方法

王蕊，楊鑫焱，陳思涵，潘瑞麗，吳霜，滿朝新，姜毓君

(東北農業大學 食品學院,乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱，150030)

黃色陰溝腸桿菌曾在1980年被更名為阪崎腸桿菌[1]，阪崎腸桿菌則在2008年被重新命名并被劃分為克羅諾桿菌屬[2]。克羅諾桿菌屬菌株已在水、肉、蔬菜、茶葉、牛奶以及嬰幼兒配方奶粉等多種食源性制品中被發現[3]。1958年，英國有2名新生兒因感染了克羅諾桿菌而死亡，這是世界上第1例報道的由克羅諾桿菌屬導致的疾病，由此越來越多的人開始關注致病菌和嬰幼兒配方奶粉之間的關系[4-5]。因此發展一個高特異性，靈敏的快速檢測阪崎克羅諾桿菌的方法對降低克羅諾桿菌屬菌株的污染風險尤為重要[6]。

嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌傳統的檢測過程包括前增菌、選擇性培養基增菌、分離顯色和生化鑒定等步驟，全過程需3～7 d才能得出結果[7]。與傳統方法相比，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術是細菌檢測技術中的里程碑[8-9]，它具有靈敏度高，特異性強，自動化操作以及耗時短等優點，廣泛應用于細菌檢測中[10-11]。然而，PCR技術在實際檢測一些復雜的基質如牛奶中的致病菌時，基質中的脂肪和蛋白質會對PCR產生強烈的抑制作用[8-9]，因此在PCR反應前進行樣品的分離是十分必要的。樣品分離方法中的免疫磁分離技術因其在食品檢測中的巨大潛力而被廣泛應用[12-14]，但是此技術需要特異性的抗體。而抗體面臨制備難度大、成本高等缺點，同樣限制了免疫磁分離技術的應用。

本研究中，氨基磁珠通過氫鍵作用和靜電相互作用，可非特異性直接吸附體系中存在的微量脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。使用磁捕獲技術結合PCR技術對目標菌株DNA進行特異性擴增，可以實現對阪崎克羅諾桿菌的檢測。此方法不需要使用抗體，原材料制備簡單，成本低廉，且前處理時間短(1～3 h)，克服了傳統方法前增菌時間過長(3～5 d)的弊端。此外，本研究在特異性試驗中不僅驗證了常見的食源性致病菌，同時也針對阪崎克羅諾桿菌的新分類驗證了克羅諾桿菌屬內的7株致病菌。綜上所述，本研究將氨基磁珠吸附DNA技術與PCR技術結合，實現了對嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌靈敏、快速以及高特異性的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯液體培養基(TSB)，胰蛋白胨大豆肉湯固體培養基(TSA)，青島高科園海博生物技術有限公司；氨基磁珠，洛陽惠爾納米科技有限公司；Triton X-100，美國Sigma-Aldrich公司；EDTA，苯酚-氯仿-異戊醇溶液，北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K，天根生化科技有限公司；PCR引物，北京諾賽基因組研究中心；PCR Master Mix，上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHWY200B恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；3K15臺式冷凍離心機，美國Sigma-Aldrich公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器公司；Mastersizer2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；Veriti梯度PCR儀，賽默飛世爾科技；KQ-500DE型數控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀有限公司；DYY-10C 型電泳儀，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養

本研究采用阪崎克羅諾桿菌(ATCC29544)作為體系優化及靈敏度驗證菌株，將其接種于TSB培養基中，在37 ℃，150 r/min的條件下培養12 h，即得到處于對數生長期的阪崎克羅諾桿菌菌液，用于后續試驗。同時本研究采用4株阪崎克羅諾桿菌及13株非阪崎克羅諾桿菌的菌株進行特異性實驗，這些菌株均參照美國模式培養物寄存庫(American Type Culture Collection, ATCC)官方網站上所提供的方法進行活化、培養和保藏。

1.3.2 氨基磁珠的活化

氨基磁珠活化過程按照說明書中所述：使用前將磁珠懸浮液充分混勻，取100 μL磁珠懸浮液(含磁珠1 mg)，磁分離棄上清；加入1 mL PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)洗滌磁珠2次，磁分離棄上清；再加入200 μL PBS，使磁珠充分分散懸浮均勻；在上述200 μL 磁珠懸浮液中，加入800 μL質量分數為25%的戊二醛，室溫條件下，在樣品混合儀上振蕩活化1 h；磁分離，棄上清；用1 mL PBS清洗活化的磁珠3次；最終將活化的磁珠分散在200 μL PBS中，即得到活化的磁珠懸浮液。

1.3.3 氨基磁珠吸附檢測體系中DNA

DNA在待測體系中被釋放的過程參考文獻并做出適當修改[8,15-16]：取10 mL待檢樣品在4 ℃以6 000×g的轉速離心20 min后，將沉淀重懸于含有質量濃度為5%的Triton X-100的500 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA,TE)緩沖液(10 mmol/L，含有1.0 mmol/L EDTA，pH值9)中，向其中加入30 μL蛋白酶K，在56 ℃條件下孵育30 min后煮沸10 min并迅速冰浴8 min，再通過苯酚-氯仿-異戊醇溶液(體積比25∶24∶1)進行萃取，即可得到粗提的DNA溶液。向粗提的DNA溶液中加入20 μL活化后的磁珠，60 ℃孵育搖動30 min后，經TE buffer清洗3次，重懸于100 μL用于后續檢測。

1.3.4 PCR反應體系的建立

本文所引用的PCR引物(5’-CGG GTT ACG CAG GGT TGA-3’; 5’-GCG GTT GCC AGT GAA TAA GAT-3’)曾被驗證針對阪崎克羅諾桿菌的PCR檢測具有較好的特異性[17]。 PCR反應體系如下：2×PCR Master Mix 12.5 μL，去離子水8.5 μL,引物各1 μL (10 μmol/L)以及DNA模板2 μL。反應循環參數如下：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃終延伸5 min，其中變性、退火和延伸這3步循環30次。PCR反應結束后取5 μL擴增產物，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證結果。

2 結果與分析

2.1 磁珠粒度分析

利用激光粒度儀對氨基磁珠的粒徑分布進行分析，結果如圖1所示。磁珠的平均粒徑為66.714 μm，聚合物分散性指數為0.762。結果表明實驗使用的氨基磁珠粒徑分布均勻且分散性良好，磁珠表面基團包被良好。

圖1 氨基磁珠粒度分布圖Fig.1 Distribution of diameter of amino-modifiedmagnetic nanoparticles

2.2 氨基磁珠吸附DNA過程的單因素優化試驗

2.2.1 TE緩沖液的pH值優化

本試驗基于1.3.3所述的方法，針對其中TE緩沖液的pH值進行了梯度優化，8組試驗的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，再分別對捕獲后的DNA進行PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實驗結果。結果如圖2所示。

M-DNA Marker D2000；0-陰性對照；1-pH 4；2-pH 5；3-pH 6；4-pH 7；5-pH 8；6-pH 9；7-pH 10；8-pH 11圖2 TE緩沖液 pH值的優化Fig.2 Optimization of pH value of TE buffer

當pH ≥10時，電泳條帶較暗，表明只有少量DNA結合到氨基磁珠上。靜電相互作用是影響氨基磁珠和基因組DNA結合的主要因素，當溶液的pH值比氨基磁珠的等電點(9.6)高時，氨基磁珠表面帶負電荷，不能吸引DNA與其結合，因此在pH≥10時只能出現微弱的電泳條帶。而當溶液的pH值低于氨基磁珠的等電點時，隨著pH值逐漸變小，pH值越來越接近DNA的等電點(4.0)，DNA表面的負電荷也逐漸減少，磁珠吸附DNA能力變弱。結果顯示當pH越接近等電點時條帶越亮，故TE緩沖液的最佳pH值為9。

2.2.2 蛋白酶K添加量的優化

本試驗基于1.3.3所述的方法，針對其中蛋白酶K的添加量進行了梯度優化，6組試驗的蛋白酶K添加量分別為0、10、20、30、40、50 μL，再分別對捕獲后的DNA進行PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實驗結果，結果如圖3所示。

M-DNA Marker D2000；0-陰性對照；1-0 μL；2-10 μL；3-20 μL；4-30 μL；5-40 μL；6-50 μL圖3 蛋白酶K添加量的優化Fig.3 Optimization of the addition of proteinase K

當蛋白酶K的添加量為30 μL時，電泳條帶最亮。當添加量小于30 μL時，基質中的蛋白質不能完全去除，在一定程度上對PCR反應產生抑制作用。而當蛋白酶K添加量大于30 μL時，容易造成蛋白酶K降解不徹底，由于蛋白酶K本身也是一種蛋白質，同樣會對PCR反應產生抑制作用，故30 μL為蛋白酶K的最佳添加量。

2.2.3 吸附時間的優化

本試驗基于1.3.3所述的方法，針對其中氨基磁珠對目標DNA的吸附時間進行了梯度優化，7組試驗的吸附時間分別為0.25、0.5、1、2、3、4、5 h，再分別對捕獲后的DNA進行PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實驗結果，結果如圖4所示。

M-DNA Marker D2000；1-15 min；2-30 min；3-1 h；4-2 h；5-3 h；6-4 h；7-5 h圖4 吸附時間的優化Fig.4 Optimization of the absorption time

在0.25、0.5、1 h的吸附時間里，電泳條帶清晰明亮，在大于1 h的捕獲時間里條帶呈現隨著時間增加逐漸變暗的變化規律，產生這一現象的原因可能是過長的吸附時間導致了氨基磁珠的氧化反應。為減少檢測時間，同時考慮到奶粉基質的復雜性，最終選擇0.5 h為最佳捕獲時間。

2.2.4 吸附溫度的優化

本試驗基于1.3.3所述的方法，針對氨基磁珠對目標DNA的吸附溫度進行了梯度優化，6組試驗的捕獲孵育溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃，再分別對捕獲后的DNA進行PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察實驗結果，結果如圖5所示。

在60 ℃的吸附溫度下電泳條帶最亮，可能原因是適宜的高溫誘發了更多雙鏈DNA打開；另一個原因可能是高溫促進了氨基磁珠和DNA分子的運動，使磁珠和DNA分子更容易碰撞結合。當溫度低于60 ℃時，碰撞結合概率降低，因此條帶逐漸變暗，而當溫度高于60 ℃，電泳條帶隨溫度升高而變暗，這是由于氨基磁珠在高溫條件下發生了氧化反應，造成了部分磁性的損失。因此，最終選擇60 ℃為最佳吸附溫度。

M-DNA Marker D2000；1-40 ℃；2-50 ℃；3-60 ℃；4-70 ℃；5-80 ℃；6-90 ℃圖5 吸附溫度的優化Fig.5 Optimization of the absorption temperature

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 實驗設計

根據單因素實驗結果，選取TE緩沖液pH值、吸附時間、吸附溫度3個因素，采用3因素3水平進行響應面設計，實驗方案及結果如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗設計與結果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

2.3.2 回歸方程的建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0軟件，通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：灰度平均值=165.03-4.11A-1.29B+1.20C-0.73AB+2.53AC-5.07BC-20.42A2-0.49B2-113.68C2。以電泳條帶的灰度平均值為響應值的精簡模型方差分析見表2，回歸模型差異性高度顯著。模型相關系數R2=98.40%，說明這種實驗方法可靠，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析是可行的。A2和C2對灰度平均值的差異顯著，說明pH值和溫度是影響磁珠吸附DNA的重要條件。

表2 回歸模型方差與分析Table 2 Analysis of variance for the fitted quadraticpolynomial

2.3.3 響應面各因素交互作用分析

利用響應面優化法對磁珠吸附DNA單因素實驗結果進行優化，各因素的交互作用如圖6～8所示。圖6表明pH值和時間的交互作用不顯著；圖7表明pH值和溫度交互作用較弱，與pH值方向比較，溫度效應面曲線相對更陡，表明pH值對電泳條帶亮度的影響小于溫度對電泳條帶亮度的影響；圖8表明時間和溫度交互作用較弱，與時間方向比較，溫度效應面曲線相對更陡，表明時間對電泳條帶亮度的影響小于溫度對電泳條帶亮度的影響。對回歸模型進行響應面分析，得到磁珠對DNA的最佳吸附條件為pH 8.92、時間0.25 h、溫度60.27 ℃，在此條件下，電泳條帶最亮。為檢驗模型預測的準確性，同時考慮到實際操作便利以及牛奶基質的復雜度，以pH 9.0，時間0.5 h，溫度60 ℃進行驗證，3次平行實驗得到的電泳條帶灰度平均值為155.34，與理論值166.043接近。因此，響應面法對磁珠吸附DNA條件的優化是可行的。

圖6 Y=f(A，B)的響應面Fig.6 Response surface of Y=f(A，B)

圖7 Y=f(A，C)的響應面Fig.7 Response surface of Y=f(A，C)

圖8 Y=f(B，C)的響應面Fig.8 Response surface of Y=f(B，C)

2.4 嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度

將10 g嬰幼兒配方奶粉(經國標法檢測不含有阪崎克羅諾桿菌)溶于90 mL生理鹽水中，經梯度稀釋后，分別取1 mL不同濃度的菌液，分別加入9 mL嬰幼兒配方奶粉稀釋液，充分混勻，獲得終濃度為105～100CFU/mL的人工污染阪崎克羅諾桿菌的嬰幼兒配方奶粉樣品。將上述樣品用本文所建立的方法檢測，結果如圖9所示，當人工污染的奶粉樣品菌液濃度為102CFU/mL時通過電泳圖能看到一條較弱條帶，而當菌液濃度為101CFU/mL時電泳圖無條帶。因此，基于本文所建立的檢測方法，嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度為102CFU/mL。

M-DNA Marker D2000；0-陰性對照；1-100 CFU/mL；2-101 CFU/mL；3-102 CFU/mL；4-103 CFU/mL；5-104 CFU/mL；6-105 CFU/mL圖9 人工污染奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度Fig.9 Detection sensitivity of C. sakazakii incontaminated PIF

2.5 磁珠吸附DNA結合PCR方法的特異性分析

針對4株阪崎克羅諾桿菌以及13株非克羅諾桿菌的菌株進行特異性實驗，結果見表3，4株阪崎克羅諾桿菌均能被特異性擴增并呈現陽性結果，而其余13株非阪崎克羅諾桿菌呈現陰性結果，證明該方法特異性良好。

表3 實驗用菌株及特異性實驗結果Table 3 Bacterial strains used in this investigation and the results of specificity test

注：+, 陽性檢測結果; -, 陰性檢測結果，下表同。

2.6 抗干擾試驗

由于氨基磁珠非特異性捕獲DNA的特點，體系中其他干擾菌株的存在可能會影響阪崎克羅諾桿菌的檢測，造成假陽性的檢測結果。因此，在終濃度為105～100CFU/mL的人工污染阪崎克羅諾桿菌的嬰幼兒配方奶粉樣品中分別混入107CFU/mL的大腸桿菌和107CFU/mL的穆斯汀克羅諾桿菌，再用本文所建立的方法進行檢測。結果如表4所示，克羅諾桿菌屬內和屬外的干擾菌株DNA均不會對阪崎克羅諾桿菌的檢測造成干擾，檢測靈敏度與沒有干擾菌株時的靈敏度結果保持一致，均為102CFU/mL。由此可知，本文所建立的檢測方法抗干擾性強，檢測結果不會受到體系中其他菌株DNA影響。

表4 干擾性試驗檢測結果Table 4 Test results of interference test

3 結論

本文建立了一個快速、靈敏和高特異性的檢測方法用于檢測嬰幼兒配方奶粉中的阪崎克羅諾桿菌。此方法通過氨基磁珠非特異性的吸附和純化奶粉樣品中基因組DNA，再通過PCR特異性擴增并最終通過瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測結果。傳統的免疫磁珠分離技術需要特異性的抗體，面臨抗體制備難度大、成本高等問題。而本文通過氨基磁珠和DNA之間的氫鍵作用和靜電相互作用，使DNA能在復雜的基質中被氨基磁珠直接吸附，避免了抗體的使用，降低了檢測成本；同時本試驗只需要1～3 h的前處理過程，克服了傳統方法的3～5 d前增菌時間過長的弊端。本研究通過優化磁珠吸附過程中的TE緩沖液的pH值、蛋白酶K添加量、吸附時間和吸附溫度，提高了檢測的效果。在優化條件下，本方法對于人工污染嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度可達102CFU/mL。此外，本文所建立的檢測方法對常見的食源性致病菌及克羅諾桿菌屬中非阪崎克羅諾桿菌均無交叉反應，同時阪崎克羅諾桿菌的檢測不會受到體系中存在的其他菌株DNA的影響。因此，此方法可以作為一種快速檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的有效手段。