利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜快速鑒定產氣莢膜梭菌

汪琦，王紫薇，趙曉娟，李丹，曹嘉悅，馬丹，曾靜

(北京檢驗檢疫技術中心，北京,100026)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)屬革蘭氏陽性產芽孢桿菌，在自然界中分布廣泛，是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥和創傷性氣性壞疽的主要病原菌之一[1-2]。人食用了受該菌污染的食品，可能會發生食物中毒事件，出現腹瀉腹痛、嘔吐、不適等急性胃腸炎癥狀[3-4]。因此，快速準確鑒定產氣莢膜梭菌對于有效防止該菌的污染及污染后病癥的防治具有重要意義。

目前，產氣莢膜梭菌的分離和鑒定主要采取傳統檢測方法[5-7]，其中，最重要的生化鑒定實驗為牛乳洶涌發酵實驗，具有特征性鑒別意義[2,6-7]。 此外，VITEK的ANC卡(生物梅里埃)和16S rRNA基因測序也常用于產氣莢膜梭菌的鑒定[8-15]。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是新近發展起來的里程碑式的微生物快速鑒定技術。通過將待測微生物的特征蛋白指紋圖譜與已知微生物的特征蛋白指紋圖譜比對實現微生物的快速鑒定。相比現有檢測方法，該方法具有操作簡單、快速、高通量、準確度高和成本低等優點。目前，該技術已成功運用于各種細菌和真菌的鑒定[11-13,16-19]，國內已利用該技術對銅綠假單胞菌、溶藻弧菌、洋蔥伯克霍爾德菌、單核細胞增生李斯特氏菌等進行了鑒定[20-23]，但在產氣莢膜梭菌鑒定方面的應用還少有報導，只有黃永祿等用MALDI-TOF MS方法快速檢測了從地震傷員創面分離出的3株產氣莢膜梭菌[24]。

本文利用MALDI-TOF MS方法對51株產氣莢膜梭菌菌株進行鑒定并將鑒定結果與其他常用鑒定方法進行比較，評估該方法是否適用于產氣莢膜梭菌的快速準確鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

標準菌株ATCC13124(A型)和ATCC12916(E型)購于美國菌種保藏中心。標準菌株CVCC1125(A型)、CVCC58(C型)、CVCC59(C型)和CVCC81(D型)購于中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。51株本實驗室保存的產氣莢膜梭菌分離株。

1.1.2 試劑

PCR引物，上海生工生物有限公司合成；rTaq酶、dNTP，日本Takara公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，北京天根公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid， CHCA)，美國Sigma公司；細菌檢測標準品(bacterial test standard，BTS)，德國Bruker公司；甲酸，美國MREDA公司；乙腈(acetonitrile，ACN)，美國賽默飛世爾公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)，美國ROE公司；無水乙醇，天津富晨；血平板，美國賽默飛世爾公司；厭氧產氣袋、ANC卡，法國生物梅里埃公司；液體硫乙醇酸鹽培養基(FTG)，北京陸橋公司。

1.2 儀器與設備

Microflex LT基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，德國Bruker公司；VITEK 2 Compact，法國生物梅里埃公司；PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Centrifuge 5424型臺式離心機，德國Eppendorf公司；Friocell 222L培養箱，德國MMM公司；厭氧盒，日本三菱公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將標準菌株和分離菌株劃線接種血平板，36 ℃厭氧培養18～ 24 h備用。

1.3.2 MALDI-TOF MS鑒定

1.3.2.1 細菌蛋白處理

常用細菌蛋白處理方式有2種，直接涂抹法和甲酸提取法。直接涂抹法：取少量新鮮培養物，直接涂布在靶板上，形成一均勻的薄層。待菌體干燥后，每個樣點覆蓋1 μL CHCA基質溶液。干燥后上機鑒定。甲酸提取法：取適量血平板上的新鮮培養物，重懸于300 μL去離子水中。加入900 μL無水乙醇。渦旋振蕩后13 000×g離心2 min。倒去上清液，再次13 000×g離心1min。用槍頭吸棄上清，室溫干燥5 min。加50 ～80 μL 體積分數為70%的甲酸溶液(甲酸的量可根據沉淀的量調整)，吹吸使沉淀充分溶解。加入等體積乙腈，渦旋振蕩后13 000×g離心2 min，取1 μL上清液點在靶板上，每個樣品點2個點。同時點1 μL BTS標準品溶液用于儀器的校正。室溫干燥后每個樣點覆蓋1 μL CHCA基質溶液。干燥后上機鑒定。

1.3.2.2 上機鑒定

打開FlexControl軟件，用BTS樣點校準儀器。采集蛋白分子質量范圍設為2 000～20 000 Da。用Biotyper RTC軟件進行菌株圖譜信息的采集和自動鑒定。

1.3.2.3 結果判定

布魯克MALDI-TOF MS系統的鑒定報告以鑒定結果和鑒定分值的形式體現。鑒定分值反映鑒定結果的可信度。其計算方法為在數據庫MSP中尋找待測樣品的峰，得到分數A，在樣品圖譜中尋找數據庫MSP中的峰，得到分數B，對比這些峰的峰高、頻率等信息，得到分數C。A，B，C滿分為1分。鑒定分值為log10(1 000×A×B×C)。鑒定分值的判定標準為：2.300～3.000為可信的種水平的鑒定；2.000～2.299為可信的屬水平的鑒定，可能的種水平的鑒定；1.700～1.999為可能的屬水平的鑒定；0.000～1.699為不可信的鑒定結果。

1.3.3 VITEK 2 Compact系統鑒定

使用ANC卡進行產氣莢膜梭菌的鑒定。用半量生理鹽水調整菌液濃度至2.8～3.3麥氏單位，抽真空后上機鑒定。未鑒定為產氣莢膜梭菌的菌株需重復鑒定1次。

1.3.4 16S rRNA基因序列測定和比對

1.3.4.1 基因組DNA提取

從血平板上取適量的新鮮細菌培養物，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，- 20 ℃保存備用。

1.3.4.2 16S rRNA基因擴增和序列比對

16S rRNA基因擴增的PCR反應體系為：10×buffer (含1.5 mmol/L MgCl2)5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL，引物(10 pmol/μL)，各2 μL，DNA模板1 μL，去離子水補充至50 μL。16S rRNA基因擴增引物序列為LPW58，5′-agg ccc ggg aac gta ttc ac-3′；LPW81，5′-tgg cga acg ggt gag gtt cga tac cag-3′。擴增反應條件為94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個循環; 72 ℃ 5 min[10]。PCR 擴增產物長度約1 200 bp。經 1% 瓊脂糖凝膠電泳確定特異條帶后，送生工生物工程(上海)有限公司測序。利用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將測序結果與NCBI數據庫中的序列進行比對。

1.3.5 牛乳洶涌發酵實驗

按照GB4789.13的5.3.3操作。取血平板上的單克隆，接種FTG培養基，36 ℃厭氧過夜培養后取1 mL接種于含鐵牛乳培養基。46 ℃水浴中培養2 h后，每小時觀察1次有無“爆裂發酵”現象。5 h內不發酵者為陰性。含鐵牛乳培養基使用鮮牛乳配制。每個分離菌株進行2次獨立實驗，2次獨立實驗均為陰性的結果記為陰性。

2 結果與分析

2.1 MALDI-TOF MS鑒定結果

2.1.1 樣品處理方法的選擇

對分離菌株進行鑒定之前，先采用廠家提供的2種樣品處理方法(直接涂抹法和甲酸提取法)，對實驗室保存的6株代表不同毒素類型的產氣莢膜梭菌標準菌株進行處理，比較樣品處理方法對鑒定結果的影響，并對MALDI-TOF MS方法的鑒定效果進行初步確認。

結果顯示，經2種方法處理的標準菌株都被準確鑒定為產氣莢膜梭菌。甲酸提取法的鑒定分值全部在2.300以上，達到了可信的種水平的鑒定。直接涂抹法41.67%(5/12)的鑒定分值在2.300以上，58.33%(7/12)的鑒定分值在1.800 ～ 2.300之間(表1)，表明直接涂抹法雖然有時能得到與甲酸提取法相當的鑒定效果，但鑒定效果不穩定。標準菌株ATCC13124經甲酸提取法和直接涂抹法得到的MALDI-TOF MS圖譜見圖1。從圖譜也可看出，相比直接涂抹法，甲酸提取法得到的圖譜基線更平穩，蛋白峰更多，重復性更好。因此，采用甲酸提取法對分離菌株進行處理。

圖1 標準菌株ATCC13124直接涂抹法和甲酸提取法的MALDI-TOF MS圖譜Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of the C. perfringensreference strain ATCC13124 using direct smear method andformic acid extraction method橫坐標表示蛋白峰的荷質比，縱坐標表示蛋白峰的相對強度；A，B為直接涂抹法2次重復得到的質譜圖；C，D為甲酸提取法2次重復得到的質譜圖。

2.1.2 分離菌株的鑒定結果

51株分離菌株的新鮮培養物經甲酸提取法處理后上機鑒定，均被鑒定為產氣莢膜梭菌且鑒定分值高于2.300，達到種水平的鑒定。鑒定結果見表2。

2.2 VITEK 2 Compact鑒定結果

51株分離菌株經VITEK鑒定，46株菌鑒定為產氣莢膜梭菌，4株菌為無法鑒定(Unidentified Organism)，1株為低分辨率(Low Discrimination)。將未成功鑒定的5株菌重新純化培養后再次鑒定，3株鑒定為產氣莢膜梭菌，2株(cp7和cp8)仍無法鑒定。比較這2株菌2次的生化反應，結果完全相同，說明這可能是VITEK數據庫中未收錄的生化型。VITEK鑒定結果詳見表2。

2.3 16S rRNA基因序列比對結果

51株分離菌株的DNA經PCR后都可以擴增出大小約為1 200 bp的目的片段。將測序所得序列在NCBI中做Blast比對，結果均為產氣莢膜梭菌(表2)。

2.4 牛乳洶涌發酵實驗

牛乳洶涌發酵實驗結果顯示，32株菌2次實驗的結果皆為陽性，15株菌2次實驗中有1次結果為陽性，4株菌(cp18，cp27，cp38和cp41)2次實驗結果均為陰性。這4株菌的16S rRNA測序、VITEK和MALDI-TOF MS 3種方法的鑒定結果均為產氣莢膜梭菌(表2)。

表2 51株分離菌株的MALDI-TOF MS、16S rRNA序列比對、VITEK 2 Compact和牛乳洶涌發酵實驗結果Table 2 Identification results of the 51 isolated C. perfringens strains using MALDI-TOF MS, 16S rRNA sequencing,VITEK 2 Compact and iron-milk presumptive test

注：+代表牛乳洶涌發酵實驗陽性；-代表牛乳洶涌發酵實驗陰性。

3 討論

產氣莢膜梭菌是一種重要的致病菌，引起細菌性食物中毒的數量在美國排第2位[25-26]。在我國，生的肉制品、水產品中也存在較嚴重的產氣莢膜梭菌污染[3,27]。因此，快速準確的鑒定方法對于產氣莢膜梭菌的日常檢測具有重要意義。

本文中，用新近發展起來的MALDI-TOF MS方法鑒定了實驗室保存的51株產氣莢膜梭菌，并將鑒定結果與16S rRNA基因序列比對方法、VITEK方法和牛乳洶涌發酵實驗等3種常用方法進行比較。實驗結果表明，VITEK和牛乳洶涌發酵實驗在鑒定產氣莢膜梭菌時都出現了假陰性的結果，用MALDI-TOF MS方法鑒定產氣莢膜梭菌更加準確(表2)。

VITEK 2鑒定梭菌屬細菌時會出現假陰性的結果在多篇文獻中已有報道。AlMogbel用MALDI-TOF MS方法和VITEK2鑒定梭菌屬的144株菌并以16S rRNA測序方法為參考，結果發現16S rRNA測序鑒定為產氣莢膜梭菌的97株菌中，95株被MALDI-TOF MS方法鑒定為產氣莢膜梭菌，而VITEK 2只鑒定出78株。VITEK 2對144株梭菌屬細菌鑒定的正確率為77.7%(112/144)，錯誤率為9.7%(14/144)，12.5%(18/144)的菌無法鑒定[11]。有些研究報道的VITEK 2鑒定梭菌屬細菌的正確率甚至更低，只有44.4%和64.3%[8-9]。

樣品處理方式會影響MALDI-TOF MS方法的鑒定結果。CHEAN用布魯克的MALDI-TOF MS系統對52株梭菌屬的菌株，包括30株產氣莢膜梭菌和22株梭菌屬的其他菌種進行鑒定，結果表明直接涂抹法處理后鑒定正確率只有69.2%，而甲酸提取法處理后鑒定正確率為100%[12]。本實驗中，也采用這2種常見的樣品處理方法對標準菌株進行處理，鑒定結果表明，樣品處理方法對鑒定結果的影響主要體現在鑒定分值上。直接涂抹法操作簡單，雖然有時也可以得到2.300以上的鑒定分值，但是由于涂抹的菌量和均勻程度很難把握，直接導致采集到的圖譜質量不穩定，鑒定分值的差異較大(表1和圖1)。總體來說，甲酸提取法的鑒定結果在穩定性和重復性上都高于直接涂抹法。選用甲酸提取法可以保證MALDI-TOF MS的鑒定結果更準確。

除了準確性，在檢測成本和速度上，MALDI-TOF MS方法也具有不可比擬的優勢。VITEK檢測1個菌株的成本在30～40元左右，大約需要8 h。而且在檢測前需要對菌株進行革蘭氏染色從而選擇相應的檢測卡。而MALDI-TOF MS方法不需要知道菌株的相關信息，檢測1個菌株的成本大約為1～2元，0.5 h內可以得到鑒定結果。與傳統的牛乳洶涌發酵實驗相比，MALDI-TOF MS方法不僅檢測時間大大縮短，從6～7 h縮短至0.5 h內，而且結果穩定，便于判斷。由于成本低，操作簡單，在實際檢測過程中，還可以通過篩選更多的可疑菌落提高鑒定結果的準確性。

綜上，相比傳統檢測方法，MALDI-TOF MS方法操作更簡便、成本更低廉，檢測時間更短，而且結果更加準確，可以作為產氣莢膜梭菌日常檢測的有效工具。