LETM 1蛋白在三陰性乳腺癌組織中的表達及與患者臨床特征和預后的關系△

呂金燕，王剛#，王若雨，朱金明，姜佳寧

1大連大學附屬中山醫院腫瘤內科，遼寧 大連1160010

2大連大學乳腺及消化腫瘤分子標志物高通量篩選及靶向藥物轉化重點實驗室，遼寧 大連116001

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長因子受體均表現為陰性的一種特殊類型乳腺癌，具有腫瘤負荷大、惡性程度高、復發轉移早等特點[1]。目前臨床上治療TNBC仍以化療為主，但因為缺乏有效的靶向治療以及預后較差等特點，導致病死率較高，是目前臨床上治療的一個難點[2-3]。近些年臨床上發現采用生物學指標對TNBC的預后進行評估，可有效改善患者預后[4]。亮氨酸拉鏈EF-hand結構域跨膜蛋白1（leucine zipper/EF-handcontaining transmembrane protein 1，LETM1）是一種在人類及酵母中都極為保守的線粒體內膜蛋白。據相關文獻報道，LETM1與線粒體形態的維持具有相關性，并且還是連接線粒體及核糖體L36蛋白構成復雜復合物的錨蛋白[5-6]。近些年LETM1蛋白在線粒體功能紊亂中的作用被廣泛關注，并且推測其與腫瘤的發生有關，但是有關其在腫瘤發展中的具體作用尚未闡述清楚[7]。本研究探討了LETM1在TNBC組織中的表達情況及與患者臨床特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年7月至2012年1月于大連大學附屬中山醫院接受手術治療的100例TNBC患者的TNBC組織標本，選取同期100例導管內原位癌患者的導管內原位癌組織標本及其癌旁正常組織標本，所有組織標本均在患者手術過程中采集。納入標準：①所有患者均經病理組織學檢查確診為TNBC或導管內原位癌；②卡氏（Karnofsky，KPS）評分≥80分，術前均未接受過放化療。排除標準：①無明顯心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙者；②腫瘤侵犯腦部且未獲得有效控制者；③臨床資料不全者。TNBC患者100例，年齡27～78歲，平均（53.67±6.84）歲；TNM分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期48例，Ⅲ期16例；有腋窩淋巴結轉移58例，無腋窩淋巴結轉移42例；所有患者均未出現腦轉移。導管內原位癌患者100例，年齡 25～76歲，平均（52.82±7.13）歲。

1.2 免疫組織化學染色

采用防脫片劑處理載玻片后，置于58～60℃恒溫箱中烘烤30～60 min。二甲苯脫蠟，于60℃恒溫箱中處理5 min，共3次。然后使用100%、95%、75%乙醇進行處理，每個濃度的處理時間為3 min。采用3%H2O2室溫處理5～10 min以滅活內源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）熱修復抗原，5%牛血清白蛋白封閉液封閉，LETM1兔抗人一抗（1∶50稀釋）4℃孵育過夜。滴加生物素標記的山羊抗兔ⅠgG二抗，37℃孵育20 min。滴加試劑SABC，37℃20 min。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片。

1.3 免疫組織化學染色結果判斷

隨機選取5個400倍的高倍視野，根據陽性細胞所占百分比評分：0分，陽性細胞所占百分比＜5%；1分，陽性細胞所占百分比為5%～25%；2分，陽性細胞所占百分比為26%～50%；3分，陽性細胞所占百分比為51%～75%；4分，陽性細胞所占百分比＞75%。根據細胞染色程度評分：無著色為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，重度著色為3分。免疫組織化學染色結果評分為上述兩項評分之和，0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中等陽性，6～7分為強陽性[8]。

1.4 隨訪情況

所有患者出院后均隨訪5年，隨訪截至2017年1月30日。總生存時間（overall survival，OS）為患者出院至死亡或隨訪截止時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件-對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LETM 1蛋白在 3種組織中表達情況的比較

TNBC組織中LETM1蛋白的陽性表達率為85%（85/100），高于導管內原位癌組織的64%（64/100）和癌旁正常組織的29%（29/100），差異均有統計學意義（P＜0.05）；導管內原位癌組織中LETM1蛋白的陽性表達率高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 LETM 1蛋白在 3種組織中的表達情況

2.2 LETM 1蛋白表達與TNBC患者臨床特征的關系

組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級、臨床分期為Ⅲ期、有淋巴結轉移的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強陽性表達率均高于組織學分級為Ⅰ級、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同年齡、絕經狀態、腫瘤直徑和p53表達情況的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 LETM 1蛋白表達與100例TNBC患者臨床特征的關系

2.3 TNBC患者OS影響因素的單因素分析

單因素分析結果顯示，年齡≥50歲、絕經后、組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級、有淋巴結轉移、LETM1蛋白表達為中等-強陽性的TNBC患者的中位OS均短于年齡＜50歲、絕經前、組織學分級為Ⅰ級、無淋巴結轉移、LETM1蛋白表達為陰性+弱陽性的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同腫瘤直徑、臨床分期的TNBC患者的中位OS比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

2.4 TNBC患者預后影響因素的多因素分析

多因素回歸分析結果顯示，淋巴結轉移和LETM1蛋白中等-強陽性表達是影響TNBC患者OS的獨立危險因素（P＜0.05）；絕經狀態、年齡、組織學分級不是TNBC患者OS的獨立影響因素（P＞0.05）。（表4）

表3 100例TNBC患者OS影響因素的單因素分析

表4 100例TNBC患者OS影響因素的多因素分析

3 討論

目前臨床上對于乳腺癌的致病原因及具體發病機制尚未完全闡述清楚，但有研究顯示乳腺癌的形成是多種因素共同作用的結果，可能是在性激素和生長因子共同作用下導致局部微環境的變化而生成[9]；也有研究表明乳腺癌的發病可能與患者的自身免疫系統有關，但是具體的發病機制還有待考證[10]。TNBC是一種特殊類型的乳腺癌，預后較差，是目前臨床研究的熱點。臨床上有學者根據基因表達將TNBC分為6個亞型，揭示了各分型TNBC的不同分子生物學特點以及治療的差異，同時也顯示了此病的特殊性[11-12]。TNBC的特殊性除了表現在分子生物學上，還體現在對化療以及靶向治療反應的差異性上，TNBC較非TNBC對化療以及新輔助化療更為敏感，只有部分TNBC患者能達到病理學緩解以及良好的預后，并且化療和新輔助化療對哪種類型的TNBC患者最為敏感還尚未十分清楚[13-15]。因此尋找合適的TNBC治療方法以及特異性靶點是目前臨床研究的熱點。為此本研究探索了LETM1蛋白與TNBC患者臨床特征及預后的關系。

LETM1蛋白在人體多種組織中均有較為廣泛的表達，其是EF臂鈣離子結合蛋白的家族成員之一。LETM1蛋白表達水平的改變可引起線粒體功能紊亂，與人類多種疾病的發生密切關聯。線粒體合成的LETM1蛋白是調節人類腫瘤的重要蛋白。研究表明，在人類多種腫瘤中出現LETM1蛋白表達水平的顯著升高，例如肝癌[16-17]、乳腺癌[18]等，這些研究均證明了LETM1蛋白在腫瘤發生發展中發揮重要作用。本研究結果顯示，TNBC組織中LETM1蛋白的陽性表達率高于導管內原位癌組織和癌旁正常組織（P＜0.05），導管內原位癌組織中LETM1蛋白的陽性表達率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。提示LETM1蛋白能反映腫瘤的進展情況，為腫瘤的早期治療提供依據。本研究發現，組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級、臨床分期為Ⅲ期、有淋巴結轉移的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強陽性表達率均高于組織學分級為Ⅰ級、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示TNBC患者中LETM1蛋白表達水平升高可能會導致腫瘤細胞的侵襲力與轉移力增強。但不同年齡、絕經狀態、腫瘤直徑和p53表達情況的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。提示LETM1蛋白可能是一種全新、有效的分子靶點。經單因素與多因素分析發現，淋巴結轉移和LETM1蛋白中等-強陽性表達是影響TNBC患者OS的獨立危險因素（P＜0.05），證明了LETM1蛋白對TNBC預后的重要性。

綜上所述，LETM1蛋白可作為臨床上判斷TNBC惡性程度的指標，是影響TNBC患者預后的重要因素，可作為TNBC患者預后預測的有效指標之一，有望成為TNBC患者潛在的生物學指標及治療靶點。