裸花紫珠提取物對銀屑病作用及機制研究

巴立娜

[摘要] 目的 探討裸花紫珠提取物抗銀屑病作用。 方法 60只KM小鼠按照隨機數字表法分為模型組、裸花紫珠提取物低劑量組、裸花紫珠提取物中劑量組、裸花紫珠提取物高劑量組和陽性藥對照組，每組各12只。分別灌胃給予生理鹽水，0.6、1.2、2.4 g/kg裸花紫珠提取物，1 mg/kg甲氨蝶呤，連續7 d。HE法檢測完整顆粒層鱗片數；Western blot技術檢測Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2蛋白表達；Real-time PCR技術檢測Caspase3、Bax、BCL-2基因mRNA表達。 結果 裸花紫珠中、高劑量組鼠尾完整顆粒層鱗片數明顯高于模型組（P < 0.05）；裸花紫珠中、高劑量組促凋亡蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax蛋白和mRNA表達均高于模型組（P < 0.05），抗凋亡蛋白BCL-2蛋白和mRNA表達下調（P < 0.05）。 結論 裸花紫珠提取物通過誘導凋亡發揮抗銀屑病作用。

[關鍵詞] 裸花紫珠；銀屑病；顆粒層；凋亡

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（c）-0014-05

Study of effect and potential mechanism of Callicarpa nudiflora extract against psoriasis

BA Li′na

Basic Medical College， Harbin Medical University （Daqing）， Heilongjiang Province， Daqing 163319， China

[Abstract] Objective To determine the anti-psoriasis effect of Callicarpa nudiflora extract. Methods Sixty KM mouses were randomly divided into 5 groups by random number table （n = 12）， including model group， Callicarpa nudiflora low-dose group， Callicarpa nudiflora middle-dose group， Callicarpa nudiflora high-dose group and positive control group. They were given to normal saline， Callicarpa nudiflora extract （0.6 g/kg or 1.2 g/kg or 2.4 g/kg） and 1 mg/kg methotrexate by gastric perfusion for seven days respectively. Lateral line scales of granular layer were detected by HE method. The expression of Caspase3， Cleaved-Caspase3， Bax and BCL-2 mRNA and protein were detected by Real-time PCR and Western blot. Results Lateral line scales of granular layer of Callicarpa nudiflora middle-dose and high-dose groups was increased than those in the model group （P < 0.05）. The expression of the pro-apoptotic proteins Caspase3， Cleaved-Caspase3， Bax mRNA and protein in callicarpa nudiflora middle-dose and high-dose groups were up-regulated than those in the model group （P < 0.05）， the expression of the anti-apoptotic protein BCL-2 mRNA and protein was down-regulated （P < 0.05）. Conclusion The Callicarpa nudiflora extract can exert anti-psoriatic effect by inducing apoptosis.

[Key words] Callicarpa nudiflora； Psoriasis； Granular layer； Apoptotic

銀屑病俗稱為牛皮癬，是一種紅斑鱗屑炎癥自身免疫皮膚病[1]，其發病率高、發病原因多樣、病程較長、對病人的身心具有嚴重影響，但是發病機制尚不明確[2-5]。發病特征主要包括表皮細胞的過度增殖、分化異常、以及凋亡減少[6]。細胞凋亡也稱為細胞程序性死亡，是一種基因調控的細胞主動性的“自殺”過程。這個過程被促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同調控[7]。Caspase3可以加速與細胞結構、細胞周期等相關的蛋白或激酶失活，導致細胞發生凋亡[8]。Caspase3活化標志凋亡進入不可逆階段[9]。BCL-2蛋白家族是調控Caspase蛋白激活的一類重要的細胞因子。BCL-2主要分為抗凋亡和促凋亡兩個亞族，其中抗凋亡亞族主要有BCL-2等，促凋亡亞族主要包括Bax等[10]。中藥裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook）傳統的藥理作用包括抗炎、解毒、收斂、止血等[11-12]。在臨床上，裸花紫珠也被用于皮膚病的治療，但其抗銀屑病的作用并未見報道。本研究擬探討裸花紫珠提取物對小鼠鼠尾銀屑病模型的作用及其機制是否與促進細胞凋亡有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級KM小鼠，體重18～22 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。許可證號：SCXK（京）2012-0001。將60只小鼠經適應性喂養7 d后（飼養室溫度20～25℃，相對濕度50%～65%）。

1.2 實驗材料

1.2.1實驗試劑

甲氨蝶呤片（MTX，上海信誼藥廠有限公司），Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2抗體（Cell Signaling公司，美國），Caspase3、BCL-2、Bax mRNA引物（Pall Life Science公司，美國），RNA逆轉錄試劑盒（Invitrogen，USA），SYBR Green PCR Master Mix（Invitrogen，USA）。

1.2.2裸花紫珠提取物

裸花紫珠藥材（產地為海南，經中國科學院華南植物園華南植物鑒定中心葉華谷研究員鑒定為裸花紫珠Callicarpa nudiflora，標本現存于中國科學院華南植物園標本館）。裸花紫珠提取物制備方法：裸花紫珠干燥葉4 kg經80%乙醇加熱回流提取3次，提取液經過濾，合并濾液，減壓蒸餾至膏狀，冷凍干燥，得到干粉。

1.3 實驗方法

1.3.1銀屑病動物模型

1.3.1.1小鼠鼠尾銀屑病模型 正常小鼠尾部，鱗狀上皮缺乏顆粒層，角質層內有殘留細胞核，為自然角化異常，類似于銀屑病角化不全的病理生理改變，故無需造模即可用其檢測藥物對銀屑病作用[13]。

1.3.2實驗動物分組與給藥處理

將小鼠按照隨機數字表法分為5組，即模型組，裸花紫珠提取物低（0.6 g/kg）、中（1.2 g/kg）、高（2.4 g/kg）劑量組，陽性藥對照組，每組12只，灌胃給藥連續7 d。

1.3.3 HE染色

將鼠尾組織取材后放入10%甲醛中固定，石蠟切片，將過夜的載有蠟片的玻片分別放入蘇木精、鹽酸酒精分化液、伊紅液；再依次放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇（2次）、乙醇與二甲苯為1∶1溶液（2次），用中性樹膠封片。晾干后顯微鏡下觀察[13]。

1.3.4 Western blot

將組織蛋白樣品經電泳、轉膜、封閉、標記抗體Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、BCL-2（1∶1000）后，用紅外熒光掃描系統檢測，以GAPDH作內參，拍照，并用圖像分析軟件odyssey1.2進行光密度積分值分析[14]。

1.3.5 Real-time PCR

將組織總RNA提取后逆轉錄，以β-actin作為內參，采用Applied Biosystems的SYBR？誖Green PCR Master Mix試劑盒步驟進行聚合酶鏈式反應。取cDNA（1 μL），依次加入SYBR Green PCR Master Mix（2×）10 μL、ROX High（50×）0.4 μL、引物0.3 μL，用PCR-grade water補齊至20 μL，反應條件為：95℃ 10 min預變性，95℃ 15 s變性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35個循環。最后使用ABI 7900熒光定量PCR儀進行定量PCR。Real-time PCR實驗結果分析采用2-△△Ct方法[15]。各基因的引物序列見表1。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸花紫珠提取物對鼠尾顆粒層形成的影響

鏡下觀察HE染色鼠尾切片的顆粒層狀態，計數每一百個鱗片上皮中有完整顆粒層的鱗片個數，共計數300，取平均值。與模型組比較，中、高劑量組裸花紫珠提取物和陽性藥對照組完整顆粒層的鱗片數目增多（P < 0.05）。見圖1。

2.2 裸花紫珠提取物對鼠尾組織凋亡蛋白表達的影響

取裸花紫珠提取物中、高劑量組鼠尾組織提取蛋白，應用Western blot檢測Caspase3、C-Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達改變。結果表明，與模型組比較，裸花紫珠提取物中、高劑量組促凋亡蛋白Caspase3表達差異無統計學意義（P > 0.05）、C-Caspase3、Bax表達均上調（P < 0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調（P < 0.05）。見圖2～3。

2.3 裸花紫珠提取物對鼠尾組織凋亡基因表達的影響

應用RT-PCR技術檢測鼠尾組織凋亡基因mRNA表達情況。結果表明，與模型組比較，裸花紫珠提取物中、高劑量組Caspase3、Bax基因mRNA表達量明顯上調（P < 0.05），BCL-2 mRNA表達量明顯下調（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，也是一種摧殘患者身心的嚴重疾病[16]。經查閱文獻，本研究選擇小鼠鼠尾銀屑病模型[17]，由于小鼠鼠尾顆粒層的缺失，其與銀屑病的生理和病理狀態十分相似，是天然的銀屑病模型。如果藥物促使顆粒層完整，可以說明此種藥物具有抗銀屑病作用[18]。因此選擇此種穩定的銀屑病模型，評價裸花紫珠提取物的藥效作用。HE染色結果顯示裸花紫珠提取物組鼠尾顆粒層的完整度高于模型組，提示裸花紫珠提取物具有抗銀屑病作用，并且可能與促進細胞的凋亡有關。

裸花紫珠的藥理作用包括消炎、解毒、收斂、止血，也被用于各種皮膚病的治療，裸花紫珠可以有效緩解炎癥皮損、疼痛，在局部抑制色素沉積，防止瘢痕形成[19]。在治療痤瘡時，裸花紫珠可以有效抑制細菌增殖，同時使毛囊閉塞的情況得到緩解，進而達到治療目的[20]。但是，裸花紫珠對于銀屑病的作用及相關的作用機制并沒有文獻報道。凋亡的發生過程中，一般伴隨多種蛋白表達的上調或者下調[21]，Caspase家族和BCL-2家族是細胞與凋亡相關重要的蛋白家族，促凋亡蛋白Caspase3和Bax上調可以誘導細胞凋亡，而抗凋亡蛋白BCL-2上調會抑制細胞凋亡。通過Western blot方法檢測凋亡相關蛋白Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax在裸花紫珠提取物組的表達情況，發現其表達均明顯增高；而BCL-2表達均顯著下降。同時，Real-time PCR結果顯示裸花紫珠提取物組促凋亡基因Caspase3、Bax的mRNA表達明顯上調，而抗凋亡基因BCL-2mRNA表達明顯下調，提示裸花紫珠提取物誘導細胞凋亡可能是通過影響凋亡蛋白及其基因表達而實現的。

本研究希望更多研究者注意到裸花紫珠治療銀屑病的藥用價值，對其相關作用機制深入探討，進而使裸花紫珠應用得到積極推廣，讓更多患者受益。

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（收稿日期：2018-04-17 本文編輯：李岳澤）