胰泰復(fù)方對胰腺纖維化大鼠腺泡細(xì)胞凋亡的影響

高麗娟 劉莉 劉華生 王科軍 鄭南

[摘要] 目的 觀察胰泰復(fù)方對胰腺纖維化大鼠腺泡細(xì)胞凋亡的影響。 方法 將60只SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、清胰利膽顆粒組和胰泰復(fù)方高、中、低劑量組。腹腔注射13.3% L-精氨酸造模后各組給藥，胰泰復(fù)方高、中、低劑量組分別給予胰泰復(fù)方22.32、11.16、5.58 g/kg，清胰利膽顆粒組給予清胰利膽顆粒2.678 g/kg，空白組、模型組均給予2 mL生理鹽水。各組連續(xù)治療30 d后取胰腺，用于TUNEL細(xì)胞凋亡檢測及Caspase-3的Western blot和免疫組化檢測。 結(jié)果 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，胰泰復(fù)方各治療組凋亡細(xì)胞面密度明顯少于模型組（P < 0.05），胰泰復(fù)方中劑量組明顯少于胰泰復(fù)方低劑量組（P < 0.05）。Western blot和免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，胰泰復(fù)方高、中劑量組與模型組比較下降顯著（P < 0.05），胰泰復(fù)方中劑量組比胰泰復(fù)方高劑量組下降亦顯著（P < 0.05）。 結(jié)論 減少胰腺腺泡細(xì)胞凋亡可能是胰泰復(fù)方延緩胰腺纖維化的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 胰腺纖維化；胰泰復(fù)方；細(xì)胞凋亡；L-精氨酸

[中圖分類號] R576 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（c）-0019-04

The effect of Yitai Compound on apoptosis of acinous cells in the rats with pancreatic fibrosis

GAO Lijuan1，2 LIU Li3 LIU Huasheng2 WANG Kejun4 ZHENG Nan2

1.Department of Rheumatology， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 2.Basic Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 3.Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin 150040， China； 4.Integrated Chinese and Western Medicine College， Binzhou Medical University， Shandong Province， Yantai 264003， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Yitai Compound on apoptosis of acinous cells in the rats with pancreatic fibrosis. Methods Sixty SD male rats were randomly divided into blank group， model group， Qingyi Lidan Granules group， and high， medium， low dose of Yitai Compound groups by random number table method. After creation of models by intraperitoneal injection of 13.3% L-arginine， all rats were given the treatment. The rats in high， medium， low dose of Yitai Compound groups were respectively given Yitai Compound 22.32， 11.16， 5.58 g/kg， Qingyi Lidan Granules group was given Qingyi Lidan Granules 2.678 g/kg， both blank group and model group were given 2 mL normal saline. The treatment lasted for 30 days. After treatment， the pancreas was taken for detecting the apoptosis by TUNEL and the expression of Caspase-3 by Western blot and immunohistochemmistry. Results The results of cell apoptosis by TUNEL showed that the area density of apoptosis in all Yitai Compound groups was significantly less than that of model group （P < 0.05）， which of medium dose of Yitai Compound group was less than that of low dose of Yitai Compound group （P < 0.05）. The expression of Caspase-3 by Western blot and immunohistochemmistry showed that high， medium dose of Yitai Compound groups were lower than that of model group （P < 0.05）， and medium dose of Yitai Compound group was lower than that of high dose of Yitai Compound group （P < 0.05）. Conclusion Reducing the apoptosis of acinous cells in pancreas may be one of the mechanisms for Yitai Compound delaying pancreatic fibrosis

[Key words] Pancreatic fibrosis； Yitai Compound； Cell apoptosis； L-arginine

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是指多種原因引起的胰腺組織的炎性疾病，因炎癥的持續(xù)性、反復(fù)性導(dǎo)致胰腺腺泡不同程度的萎縮、變形，部分胰腺纖維化、鈣化，最終功能損壞。該病臨床表現(xiàn)多樣，病程遷延，并發(fā)癥多，一般預(yù)后不良。細(xì)胞凋亡是指機(jī)體中正常組織細(xì)胞在受到各種刺激后出現(xiàn)的、按照一定程序發(fā)生的自發(fā)性死亡[1]。細(xì)胞凋亡對維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)、組織分化、器官發(fā)育等有重要意義。Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必需因子，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，亦是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分。本研究前期在血清學(xué)、組織形態(tài)學(xué)方面對胰泰復(fù)方防治胰腺纖維化做了很多研究與報(bào)道，并用13.3% L-精氨酸溶液成功復(fù)制大鼠胰腺纖維化動物模型。本研究擬通過觀察Caspase-3蛋白的表達(dá)變化，探討胰泰復(fù)方在胰腺腺泡細(xì)胞凋亡方面防治CP胰腺纖維化的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60只SPF級健康SD雄性大鼠，6月齡，體重（180±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[動物合格證號：SCXK（黑）2015-003]。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，室溫20～22℃，濕度40%～70%，每日光照12 h。

1.2 藥物

胰泰復(fù)方組成：茯苓15 g、人參15 g、當(dāng)歸15 g、炒白術(shù)15 g、柴胡15 g、桃仁10 g、紅花10 g、佛手10 g、郁金10 g、甘草10 g（藥物均來自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院草藥局），加8倍量水浸泡藥物4 h，煎煮1 h，濾出藥液，再加6倍水，煎煮1 h，2次濾液合并，濃縮成濃度為1∶1的水煎劑。清胰利膽顆粒由長春銀諾克藥業(yè)有限公司提供（批號：20160951）。

1.3 分組與給藥

按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、清胰利膽顆粒組、胰泰復(fù)方低劑量組、胰泰復(fù)方中劑量組、胰泰復(fù)方高劑量組。除空白組外，其余各組大鼠在左下腹腔注射13.3% L-精氨酸3次，3 d給藥1次，每次分2次給藥，按大鼠2 g/kg計(jì)算劑量，空白組用2 mL生理鹽水（造模標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]）。自第11天開始灌胃，胰泰復(fù)方中劑量組為11.16 g/kg（按正常成人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算）；胰泰復(fù)方低劑量組為5.58 g/kg（胰泰復(fù)方中劑量組劑量的1/2倍）；胰泰復(fù)方高劑量組為22.32 g/kg（胰泰復(fù)方中劑量組劑量的2倍）；清胰利膽顆粒組為2.678 g/kg（正常成人30 g/d）；空白組、模型組用2 mL生理鹽水，每日1次，連續(xù)30 d。

1.4 標(biāo)本采集

大鼠斷頸處死，開腹用眼科剪取胰腺分兩部分：一部分錫紙包裹后立即置于液氮，再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱，用于Western blot檢測；一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于原位末端標(biāo)記法（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測及免疫組化檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

凋亡細(xì)胞主要表達(dá)于細(xì)胞核，TUNEL檢測在顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞為棕色，正常細(xì)胞為藍(lán)紫色。各組原位凋亡細(xì)胞TUNEL檢測結(jié)果顯示，空白組為正常藍(lán)紫色細(xì)胞，模型組可見最多的棕色凋亡細(xì)胞，清胰利膽顆粒組可見較多棕色凋亡細(xì)胞，胰泰復(fù)方高劑量組可見正常藍(lán)紫色細(xì)胞及少量棕色凋亡細(xì)胞，胰泰復(fù)方中劑量組亦可見正常藍(lán)紫色細(xì)胞及少量棕色凋亡細(xì)胞，胰泰復(fù)方低劑量組可見較多棕色凋亡細(xì)胞（圖1，封四）。

原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，模型組胰腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞面密度明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；各治療組胰腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞面密度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；胰泰復(fù)方中劑量組胰腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞面密度明顯低于胰泰復(fù)方低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測胰腺Caspase-3蛋白的表達(dá)

顯微鏡下細(xì)胞漿或細(xì)胞核中Caspase-3有表達(dá)者為棕黃色顆粒，無棕黃色顆粒則為無表達(dá)。Caspase-3抗原陽性細(xì)胞呈棕黃色，胞漿胞核均有表達(dá)，但以胞漿表達(dá)為主。各組胰腺Caspase-3蛋白表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果顯示，空白組中未見棕黃色顆粒，模型組細(xì)胞胞漿胞核中均可見較多棕黃色顆粒，清胰利膽顆粒組也可見較多棕黃色顆粒，胰泰復(fù)方高劑量組棕黃色顆粒較少，胰泰復(fù)方中劑量組棕黃色顆粒也較少，胰泰復(fù)方低劑量組可見較多棕黃色顆粒（圖2，封四）。

免疫組化檢測胰腺Caspase-3蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；胰泰復(fù)方高、中劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；胰泰復(fù)方中劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)低于胰泰復(fù)方高、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 Western-blot檢測胰腺Caspase-3蛋白的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。治療后，各治療組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下降，顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。胰泰復(fù)方中劑量組與胰泰復(fù)方高、低劑量組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3、圖3。

1.空白組；2.模型組；3.清胰利膽顆粒組；4.胰泰復(fù)方高劑量組；5.胰泰復(fù)方中劑量組；6.胰泰復(fù)方低劑量組

圖3 各組胰腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)情況

3 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體用來去除異常生長細(xì)胞和老化細(xì)胞的一種重要機(jī)制，是維持細(xì)胞群體動態(tài)平衡的重要因素[2-5]，然而過多或過少的細(xì)胞凋亡都會引起疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡可由多種因素誘導(dǎo)（如病毒感染、藥物、缺氧等），是一個(gè)信號依賴的過程，其在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為核染色質(zhì)凝縮、胞質(zhì)濃縮、DNA大規(guī)模斷片化、細(xì)胞膜內(nèi)陷、發(fā)泡形成凋亡小體[6-9]。

Caspase亦稱為死亡蛋白酶或細(xì)胞介素IB轉(zhuǎn)化酶（ICE），是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶[10-11]。Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)的匯集是在Caspase-3上[12-14]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必需因子，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，亦是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分。Caspase-3以酶原的形式合成、存儲，只有在細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)中才被活化[15]。Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡的早期反應(yīng)，在凋亡過程中起著重要作用。活化的Caspase-3可以破壞細(xì)胞內(nèi)多種蛋白酶復(fù)合體，激活核內(nèi)核酸酶，造成DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。

胰腺外分泌腺泡萎縮，繼而由增生的纖維組織代之，是CP胰腺病理組織學(xué)改變的最主要表現(xiàn)，而胰腺腺泡的減少是胰腺纖維化的前提[17-20]。胰腺腺泡減少有兩種方式：壞死和凋亡[21]。人、鼠CP組織中均存在胰腺腺泡細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[22]。因此，誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致胰腺實(shí)質(zhì)萎縮，是CP胰腺纖維化形成的主要機(jī)制之一。目前已知的兩條經(jīng)典的凋亡途徑是線粒體損傷途徑（內(nèi)源性途徑）和死亡受體活化途徑（外源性途徑）[23-25]。

本研究通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)模型組凋亡細(xì)胞面密度顯著高于空白組，說明CP胰腺中確實(shí)存在腺泡細(xì)胞的凋亡；同時(shí)免疫組織化學(xué)法及Western blot法檢測顯示模型組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，再次證實(shí)CP時(shí)大鼠體內(nèi)已啟動細(xì)胞凋亡。治療后胰泰復(fù)方中劑量組顯著優(yōu)于模型組，同時(shí)該組也下調(diào)了Caspase-3蛋白表達(dá)，提示胰泰復(fù)方可阻止Caspase-3的活化，從而阻止細(xì)胞凋亡，抑制CP胰腺纖維化的進(jìn)程，這也說明胰泰復(fù)方延緩胰腺纖維化的機(jī)制可能是與減少胰腺腺泡細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外，本研究將胰泰復(fù)方分為高、中、低三組，結(jié)果顯示中劑量即按正常成人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算的劑量療效最佳。

CP的主要病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，本虛即脾虛，標(biāo)實(shí)即氣滯血瘀。脾虛氣血生化無源，而致肝失濡養(yǎng)，肝疏泄不利，氣機(jī)郁滯則血瘀。本研究以健脾疏肝活血法為原則，在四君子湯和復(fù)元活血湯基礎(chǔ)上化裁而成胰泰復(fù)方。方中白術(shù)、人參、茯苓為君，健脾益氣；桃仁、柴胡、當(dāng)歸為臣藥，疏肝活血止痛；佐以郁金、紅花、佛手理氣活血；使以炙甘草補(bǔ)氣、調(diào)和諸藥。諸藥合用，行健脾益氣、行氣活血之效。

本研究顯示，通過抑制胰腺腺泡細(xì)胞凋亡可能是胰泰復(fù)方防治CP胰腺纖維化的作用機(jī)制之一。

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（收稿日期：2018-03-08 本文編輯：張瑜杰）