我國優質蜂王漿評價指標的探索與建議

胡菡 李建科│文

中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093

前言

蜂王漿是蜜蜂哺育蜂咽下腺和上顎腺的分泌物，用來哺育蜂王和1～3日齡蜜蜂幼蟲的白色或淡黃色乳狀液體[1-5]。蜂王漿是天然功能性蜂產品，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調節免疫及護膚美容等多方面生理作用[6-14]。中國是世界蜂王漿第一生產國，年產約4000噸，也是第一出口國，世界上90%以上的蜂王漿來自于中國[15-17]。

蜂王漿成分復雜，營養豐富，水分含量為60.0%～70.0%，蛋白質含量為12.0%～15.0%，脂類物質為3.0%～6.0%，碳水化合物為10.0%～16.0%，小分子物質（如維生素、礦物質、游離氨基酸）為2%～3%[1,15，18-23]。蛋白質是蜂王漿中含量最豐富的有機成分，約占干物質的30%～50%[15；24-26]。而王漿主蛋白家族（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占蜂王漿可溶性蛋白質含量的80%以上[22,27]。其中，MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4和MRJP5約占MRJPs總量的82%～90%[28]，它們是、蜂王漿生物學功能的主要體現者，因此，隨著對蜂王漿成分和功能認識的不斷深入，對MRJPs研究正在不斷深化。

蜂王漿的品質與新鮮度之間存在密切的關系。在蜜蜂進化過程中，為了給蜂王提供最高效的食物，哺育蜂是以交喙的方式分泌蜂王漿飼喂給蜂王。哺育蜂也只是在幼蟲需要進食時才分泌蜂王漿飼喂它們。哺育蜂一天會訪問一個幼蟲大約1,300次，在整個幼蟲的發育期的訪問次數會超過10,000次，特別是封蓋前一天訪問近3,000次[29]。這種進化方式最大程度的保證了蜂王漿的新鮮度，從而提供最高效的營養。然而蜜蜂的進化特征造就了蜂王漿是一種極其不穩定的天然產物，對儲藏條件要求較高，各種因素包括溫度、時間、空氣、水蒸氣和光都會對其產生影響[30]。日本研究表明，在室溫下儲藏1周，蜂王漿中蛋白質就有明顯降解，儲藏1個月會就發生質變[30]。隨儲藏時間的增長，蜂王漿顏色加深，黏度增大，產生氣泡；水溶性蛋白和單糖含量降低，可滴定酸增加，維生素C含量降低，SOD酶活力下降，抑菌性下降[31-33]。因此，蜂王漿的儲藏和保鮮一般在隔氧避光條件下進行低溫冷凍包藏。若儲藏不當，其各種性狀（物理或化學）及其品質就會發生顯著變化，蜂王漿的各種活性成分損失，其保健功能就會大幅降低，甚至喪失[34]。

我國蜂業生產的現實是蜂農轉地放蜂，餐風露宿，生活條件十分艱苦。野外生活根本不可能有冰柜把生產的蜂王漿及時冷凍。很多收購商一周時間到蜂王漿生產集中的蜂農那里收購一次。零散的放蜂戶生產的蜂王漿可能室溫保存時間獲更長。因此蜂王漿的新鮮度受到極大挑戰。我國是蜂王漿生產和出口大國，世界各國對蜂王漿的品質要求日趨嚴格，但現行的質量評價標準仍具有局限性和單一性，因而，有必要探求和確定能真實、準確反映蜂王漿在條件變化下的品質指標，并建立快速、高效的蜂王漿品質變化鑒別方法是行業發展的需求。

優質蜂王漿10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）指標應適當提高

蜂王漿是天然的功能性保健品，其保健功能在于其含有的多種生物活性物質。又因為蜂王漿自身具有抑菌功能，只要包藏得到，取漿后無需任何后期加工，其所含生物活性物質也能夠長期保存。因此，對蜂王漿品質的全面評價需要兼顧真偽和新鮮度兩方面。

10-HDA是一種特殊的不飽和脂肪酸，又稱王漿酸，在自然界中，僅蜂王漿中存在此種特殊的生物活性物質[35]。又因10-HDA在蜂王漿中含量穩定，國際公認其為蜂王漿的質量標準。我國現行國標《中華人民共和國國家標準 蜂王漿》（GB 9697-2008）將蜂王漿分為優等品和合格品兩個等級，規定其中10-HDA含量分別為≥1.8%和≥1.4%。2016年9月，國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）正式頒布的由中國、日本、法國、意大利、德國、土耳其、美國、泰國、馬來西亞、印度、阿根廷、巴巴多斯等國家共同參與制定的蜂王漿國際標準（ISO 12824 : 2016）中也對10-HDA進行規定，要求不得低于1.4%。而外銷出口蜂王漿中10-HDA含量一般要求在2.0%以上。10-HDA的經典和標準檢測方法為高效液相色譜法，此方法準確、易操作。

但大量研究證實10-HDA非常穩定，即使在高溫下也不會大量分解[30,36]。我們前期的研究發現，室溫存放24周，蜂王漿中10-HDA的含量沒有顯著變化。因而，10-HDA并不適合作為蜂王漿新鮮度的評價指標，但作為蜂王漿真假的判斷標準，其含量能在一定程度上反應蜂王漿的質量[21,37]。

蜂王漿中10-HDA含量受地理位置和花期影響而有所不同。研究發現云南省2009 年野藿香和2010年石榴、鬼針草3種植物生產的6種蜂王漿樣品中，10- HDA含量均在1.8%～2.1%[38]。湖北、安徽等地蜂群生產的15個新鮮油菜蜂王漿樣品中10- HDA含量范圍為1.7%～1.9%[39]。來自我國19個省138個蜂王漿樣品的10-HDA含量，發現我國西部地區10-HDA含量（2.01±0.05 %）顯著高于東部地區(1.75±0.03%)和東北部地區(1.87±0.05%)；而不同花期10-HAD含量也不同，油菜、椴樹和荊條花期蜂王漿中10-HDA含量分別為1.92%、1.80%和1.68%[40]。我們于2015年、2016年、2017年6～8月連續3年在北京地區進行蜂王漿生產試驗，分別為2.16±0.14%，2.08±0.06%，2.21±0.04%（圖1），3年間的測定結果差異不顯著[41]，均高于1.8%。由此可見，蜂王漿中10-HDA含量受地理位置和花期影響而有所不同。綜合我國生產實際，優質蜂王漿的中10-HDA 含量應高于1.8%。

2015年，2016年和2017年的6至8月連續3年在北京地區進行蜂王漿生產試驗，測定其中10-HDA含量。每年獲取20箱蜂3輪的生產數據。

圖1 不同年份生產蜂王漿中10-HDA含量

蜂王漿主蛋白含量變化可真實反應蜂王漿新鮮度，應納入優質蜂王漿質量指標

蜂王漿具有重要的生物學功能與其含有的MRJPs密切相關[26,42]，在蜜蜂生物學方面，MRJPs 參與決定蜂群中雌性蜂的級型分化[43,44]，為幼蟲發育提供必要的可利用氮元素以及可能在蜜蜂行為調控中起作用等[45-47]。另外，MRJPs 對其他動物機體具有作用，主要表現為高效的抗菌活性，較強的免疫活性和促進特殊細胞增殖等[48]。例如，MRJP2具顯著的有抗菌活性[49]；MRJP3在體內外均有免疫調節作用[50]。MRJP功能證據少，發給你的文章里有很多 因而，MRJPs在蜂王漿中的含量直接影響蜂王漿的功能，是蜂王漿品質的標志。

蜂王漿主蛋白作為評價蜂王漿新鮮度的標準并非我們第一次提出。日本科學家Kamakura 等人在2001年提出，隨著溫度升高和儲存時間的延長，蜂王漿中MRJPs的含量也顯著降低，其中一種57kD的蛋白可作為評價蜂王漿新鮮度的指標[30]，實際上這種蛋白是MRJP1，也有人建立了ELISA法，通過準確定量MRJP1濃度來評價蜂王漿新鮮度[51]，但含量在蜂王漿最高，做新鮮度指標不合適，并且一直未能在產業上應用。采用檢測靈敏度較高的雙相電泳和飛行時間質譜聯用的方法發現，在4℃和-20℃的存放條件下，儲存1年后，MRJPs含量顯著降低，特別是MRJP3、MRJP4和MRJP5；特別是室溫存放一年后，MRJPs已經降解嚴重，MRJP3-5已經檢測不到；建議采用MRJP5作為評價蜂王漿新鮮度的標準[52,53]。

最近我們通過高分辨質譜和生化檢測驗證對蜂王漿中的所有蛋白質進行了一個隨貯存溫度和時間的監測，發現蜂王漿中可溶性蛋白質隨貯存溫度的升高和時間的加長都有很大程度的降解；MRJP1-5的含量最高，且含量穩定，占總可溶性蛋白的80%以上，易于檢測；其中，MRJP1和MRJP2含量最高，但表現對溫度不敏感，在室溫和4℃存放4周降解不明顯，甚至在37℃能夠穩定存在1周。MRJP3-5對溫度非常敏感，在室溫和4℃存放隨時間延長而逐漸降解，在室溫存放2周開始，3種蛋白含量開始顯著降低；MRJP4在這3中蛋白中含量最低，對高溫也更加敏感，在37 ℃條件下存放3天，MRJP4就已經完全降解而檢測不到（圖2）。因此，MRJP3和MRJP4作為蜂王漿質量（新鮮度）檢測的標記物最佳。

圖2 不同溫度存放不同時間后MRJP1，MRJP2，MRJP3和MRJP4含量Western-Blotting檢測

根據上述原理，為了準確對這幾種蜂王漿主蛋白進行準確定量，我們針對MRJP1-5制作了單抗，能夠明確區分這5種同源性較高的蛋白質。利用MRJP3和MRJP4的單抗，我們已經研發制作成了雙夾心ELISA試劑盒，分別對這兩種蛋白進行準確定量。雙夾心ELISA需要獲得針對受檢蛋白的一對異性抗體，先將一種特異性抗體結合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢樣品中的相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記的另一特異性抗體與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，判斷抗原含量。由于采用了特異性抗體對，大大減少了假陽性反應。在進行同源性較高蛋白家族中某一種蛋白的定量時更加準確。雙夾心ELISA試劑盒體系穩定、準確性高，在實際檢測中應用非常廣泛[54-56]，也被應用于國家和地方檢測標準。因而，通過對這兩款試劑盒平行性和穩定性的多次檢測，確定這兩款試劑盒能夠做到對MRJP3和MRJP4的準確定量從而評定蜂王漿的新鮮度。

結論

基于上述研究進展與分析測試，我們認為優質蜂王漿的10-HAD含量至少應為1.8%；同時MRJP3和MRJP4應增加為優質蜂王漿新鮮度的判定指標，其含量應分別大于或等于0.8g/100g和0.2g/100g。由于理論研究和技術創新問題，蜂王漿新鮮度在現行的國標和國際標準都未曾涉及，但基于目前技術發展狀況，將MRJP3和MRJP4作為新鮮度指標時機基本成熟。將此新鮮度指標作為優質蜂王漿指標具有一定的創新，對引領產業發展具有重要意義。

蜂王漿對我國蜂產業發展至關重要，也是最具市場競爭力、最具高附加值的蜂產品。作為世界蜂王漿生產和出口第一大國，我們不僅只是生產大國，而且要通過科技創新，形成支撐產業發展的理論，通過技術創新和產品創造，實現引領消費，最終實現產業轉型。通過對近年來國內蜂王漿成分、功能研究以及蜂王漿標準的研讀，我們在現有蜂王漿質量標準的基礎上，嘗試性提出了我國優質蜂王漿的標準，這對我國蜂產業發展具有重要意義。