淫羊藿苷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損害的保護(hù)作用及其作用機(jī)制分析

趙丹陽(yáng)

（遼寧省沈陽(yáng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110041）

腦缺血性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)細(xì)胞死亡主要以凋亡為主[1-2]。淫羊藿苷是從小檗科淫羊藿屬植物中提取的有效成分，是一種黃酮醇苷類化合物，具有增加腦血流量、改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫、抗細(xì)胞凋亡等作用，但是該藥物對(duì)缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。因此，為了能夠更好的掌握該藥物的作用機(jī)制，本文主要針對(duì)神經(jīng)缺血再灌注損害中采用淫羊藿苷醫(yī)治的保護(hù)作用展開(kāi)探討。具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究需要3只清潔級(jí)昆明小鼠孕婦。其他所需的材料有純度＞98%的淫羊藿苷、多聚賴氨酸、四甲基偶氮唑藍(lán)以及用于LDH和ROS檢測(cè)的試劑盒。淫羊藿苷在準(zhǔn)備使用時(shí)運(yùn)用少量的無(wú)水乙醇助溶，在沸水中進(jìn)行水浴加熱，并在使用時(shí)進(jìn)行稀釋，稀釋采用生理鹽水，最終使得淫羊藿苷的濃度表現(xiàn)為3.2 mg/L、1.6 mg/L、0.4 mg/L。

1.2 方法：將孕鼠采取斷頸的方式處死后對(duì)其進(jìn)行消毒，消毒時(shí)采用75%的乙醇浸泡的方式，消毒所用時(shí)間為5 min，之后將鼠的兩側(cè)子宮取出，將其剪開(kāi)并將胎鼠取出。取出后將顱骨剪開(kāi)并取出腦組織。隨后進(jìn)行凋亡檢測(cè)，主要有流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、Western blot/ realtime PCR檢測(cè)Bcl-2，Bax，caspase-3/8/9、免疫熒光細(xì)胞檢測(cè)。在完成上述檢測(cè)后進(jìn)行PI3K/AKT及JNK通路檢測(cè)Western blot:AKT蛋白檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程中運(yùn)用PI3K/AKT抑制劑LY294002、JNK抑制劑SP600125。

表2 對(duì)比各組單胺類遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量（）

表2 對(duì)比各組單胺類遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量（）

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1.3 觀察指標(biāo)：本次研究的觀察指標(biāo)為對(duì)比各組細(xì)胞的存活率，以及對(duì)比各組細(xì)胞外液的LDH和細(xì)胞ROS水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：這次研究中各項(xiàng)與所選取患者相關(guān)的數(shù)據(jù)都導(dǎo)入到SPSS18.0中進(jìn)行處理，使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示計(jì)量資料，t作為檢測(cè)指標(biāo)，計(jì)數(shù)資料則使用百分?jǐn)?shù)的形式來(lái)表示，卡方作為檢測(cè)指標(biāo)，其中P＜0.05時(shí)證明數(shù)據(jù)之間具有明顯的差異存在。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)比各組細(xì)胞的存活率：對(duì)本次研究所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯示，正常對(duì)照組的所有細(xì)胞均存活，細(xì)胞存活率高達(dá)100.0%。中劑量淫羊藿組的細(xì)胞存活率為83.7%、高劑量淫羊藿苷組的細(xì)胞存活率為81.5%，低劑量淫羊藿苷組的細(xì)胞存活率為67.8%。OGD模型組的存活率為51.0%。正常對(duì)照組和高、中、低劑量淫羊藿組的細(xì)胞存活率均明顯高于OGD模型組，組間數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，χ2=6.082、11.082）。

2.2 對(duì)比各組的細(xì)胞外液LDH和細(xì)胞ROS水平：對(duì)本次研究所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯示，高、中、低劑量的淫羊藿組和OGD模型組的細(xì)胞外液LDH和ROS水平明顯高于正常對(duì)照組，各組數(shù)據(jù)對(duì)比，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)比各組細(xì)胞外液LDH和細(xì)胞ROS水平（）

表1 對(duì)比各組細(xì)胞外液LDH和細(xì)胞ROS水平（）

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2.3 對(duì)比各組單胺類遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量：數(shù)據(jù)顯示，正常對(duì)照組和高、中、低劑量淫羊藿組的谷氨酸、谷氨酸胺、Y-氨基丁酸的含量明顯低于OGD模型組；多巴胺和天冬氨酸的含量明顯高于OGD模型組，差異存有統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

3 討 論

近些年對(duì)腦缺血再灌注損傷的研究中可發(fā)現(xiàn)，其病理過(guò)程受到較多因素的影響，比如說(shuō)有因?yàn)檠趸瘧?yīng)激而導(dǎo)致的離子平衡呢紊亂、氧自由基損傷、凋亡和炎癥損傷等等[3]。腦組織當(dāng)中的不飽和脂肪酸的濃度比較高，需要消耗掉比較多的氧氣含量，具有較為敏感的氧化應(yīng)激損傷，在腦組織缺血和再灌注的過(guò)程中均產(chǎn)生有較多的氧自由基。如果機(jī)體自身的清除能力不能承受起生成的氧自由基，就會(huì)導(dǎo)致發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，多余的脂質(zhì)過(guò)氧化物和自由基會(huì)破壞神經(jīng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而使得腦組織損傷加重。神經(jīng)細(xì)胞在臨床上的凋亡進(jìn)展主要有以下幾點(diǎn)：第一是缺血缺氧本身激活了凋亡蛋白因子及有關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生；第二是大量氧自由基對(duì)神經(jīng)元造成嚴(yán)重?fù)p傷的同時(shí)，也誘導(dǎo)了凋亡的發(fā)生；第三是線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，從而在凋亡發(fā)生過(guò)程中起重要作用；第四是鈣超載激活一系列鈣依賴性酶促反應(yīng)，促進(jìn)了凋亡的發(fā)生。

在本次研究中運(yùn)用胚鼠神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型的制作采用缺氧缺糖和復(fù)糖復(fù)氧模擬缺血再灌注，采用淫羊藿來(lái)干預(yù)細(xì)胞缺糖缺氧缺血與復(fù)糖復(fù)氧再灌注，從神經(jīng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制入手，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，研究中藥活性成分淫羊藿苷能否調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)探討神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制，并探討中醫(yī)藥防治神經(jīng)細(xì)胞凋亡的防治效果和作用機(jī)制，為臨床防神經(jīng)缺血性腦病提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制高濃度的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的神經(jīng)元調(diào)亡；抑制tau蛋白的過(guò)度磷酸化抑制AP的神經(jīng)毒性；減少TNF-α、IL-6、COX表達(dá)以及減少過(guò)氧化物的含量；促進(jìn)一氧化氮合成酶的表達(dá)進(jìn)而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。淫羊藿苷通過(guò)JNK/ p38MAPK信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活而減少 NO、前列腺素 E2、活性氧自由基（ROS）的釋放，還可以減少 TNF-α、IL-lp、IL-6等的生成，發(fā)揮抗炎癥及抗氧化應(yīng)激作用。

研究結(jié)果表明，淫羊藿苷能夠使得神經(jīng)細(xì)胞的存活率得到明顯的升高，并使得神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，進(jìn)而使得細(xì)胞外液中LDH和神經(jīng)細(xì)胞ROS的水平得到顯著的降低。在細(xì)胞的凋亡中ROS具有十分關(guān)鍵的作用，ROS在受到信號(hào)的刺激下會(huì)升高其水平，明顯降低線粒體跨膜電位，從而引發(fā)線粒體將細(xì)胞色素C釋放出來(lái)[5]，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本次研究中淫羊藿苷能夠使得缺塘缺氧后的細(xì)胞存活率得到提高，使得ROS的生成得到有效的減少，由此可說(shuō)明ROS在淫羊藿苷的神經(jīng)保護(hù)中能夠發(fā)揮重要作用。在ROS的生成中人體內(nèi)會(huì)有多種酶的參與，最為主要是是黃嘌呤氧化酶、環(huán)氧合酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶這三種，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶能夠使得細(xì)胞內(nèi)ROS的水平得到快速的提高，與此同時(shí)還可以使得信號(hào)向核內(nèi)轉(zhuǎn)移得到加快[6]，從而參與到細(xì)胞的整個(gè)分化凋亡過(guò)程中。淫羊藿苷可以使得ROS的生成得到明顯的減少，這也從側(cè)面說(shuō)明淫羊藿苷很有可能是一種新型的抗氧化劑[7]。綜上所述，在神經(jīng)細(xì)胞的缺血再灌注損傷中，采用淫羊藿苷能夠起到保護(hù)作用，減少神經(jīng)細(xì)胞中ROS的生成與保護(hù)作用有著較大的關(guān)聯(lián)。