聯用凝膠色譜凈化和超高效液相色譜定量分析植物油中的苯并芘

房 芳 寧 暉 邵亮亮 杜京霖 高夢莎 趙美鳳

(浙江省糧油產品質量檢驗中心，杭州 310012)

苯并芘［benzo(a)pyrene，B(a)P］是一種五環(huán)芳香烴類化合物，簡稱3，4－苯并芘，其化學結構式如圖1。1933年，英國學者從煤焦油中分離出苯并芘，并誘發(fā)了小鼠皮膚癌，使B［a］P成為第一個被發(fā)現的化學致癌物［1－2］。我國對環(huán)境及食品中苯并芘的限量標準分別為空氣質量日平均濃度小于0.001 μg/m3、生活飲用水小于 0.01 μg/L;肉制品、熏烤動物性食品及糧食小于 5.0 μg/kg、植物油小于 10 μg/kg［3－4］。食品中的苯并芘的主要來源包括:熏烤食品，大氣灰塵和顆粒的沉降，油料的加工過程中炒制溫度過高熱解產生苯并芘［5］。

目前國內外關于苯并芘的常規(guī)檢測方法有:熒光分光光度法［6］、薄層層析法、高效液相色譜法［7］、氣相色譜－質譜(Gas Chromatography－Mass Spectrometer，GC －MS)聯用法［8］等。由于苯并芘具有較強的親油性，因此在糧油檢測中，植物油中的苯并芘檢測意義重大。食用油中苯并芘的檢測分為樣品的預處理和檢測兩個基本過程。由于食用油中的苯并芘含量少、穩(wěn)定性差、在油中易吸附，且存在多種潛在干擾物質:如大量甘油三酯、脂肪物質等，降低了后續(xù)分析儀器的靈敏度，從而影響最終的分析結果，因此對樣品的前處理要求很高。我國檢測食用油中苯并芘主要采用國標(GB 5009.27—2016)［9］，前處理分為兩種:一種采用中性氧化鋁柱凈化另一種采用苯并(a)芘分子印跡柱。這兩種前處理方法都存在處理復雜、耗時長、試劑耗費量大、對人員要求高等問題，因此建立一種準確、簡便、快速的前處理方法可以更好的為苯并芘定量定性工作提供重要的基礎保障。凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)是利用多孔的凝膠聚合物將化合物按分子空間結構差異(分子質量大小)進行選擇性分離，不能進入凝膠孔隙的分子會很快隨流動相洗脫，而能夠進入凝膠孔隙的分子，則需要更長的沖洗時間才能夠流出固定相，從而實現對不同組分的分離［10］。利用這個原理，油脂中的苯并芘檢測完全可以用凝膠色譜串聯液相色譜完成，由于儀器的全自動化，大大減輕了填柱，過柱等人工勞動，且回收率也可達到90%以上。此外在檢測過程中引入了超高效液相色譜，相較與高效液相色譜，靈敏度更高，出峰時間更快，大大提高了檢測效率。

本研究擬在國標GB 5009.27—2016的基礎上優(yōu)化，建立一種植物油中定量檢測苯并芘的方法，通過凝膠色譜對植物油樣品進行凈化，采用超高效液相色譜檢測。并且按照歐盟2002/657/EC法規(guī)［11］標準對該方法進行方法學驗證。應用該方法，可以實現植物油中的苯并芘半自動化檢測，降低人工操作壓力，提高檢測通量;此外，還可以降低由人工操作引入的不確定度，提高檢測精度。該方法的建立對常規(guī)實驗室有不可忽視的積極意義。

圖1 苯并芘分子結構

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

1290Infinity超高效液相色譜儀:美國安捷倫公司;Freestyle凝膠色譜:LCTech GmbH公司。

1.1.2 試劑

環(huán)己烷、乙酸乙酯［色譜純，天地(TIDIA)公司，美國］;乙腈(色譜純，默克公司，德國)，苯并芘標準品(濃度20 μg/mL，農業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理條件

準確稱取0.8 g油樣加入10 mL乙酸乙酯和環(huán)己烷(1∶1，V∶V)混合溶液，取6.4 mL 上述溶液采用凝膠色譜凈化。

凝膠色譜條件:色譜柱填料:Bio Beads s－X3聚乙烯凝膠填料;流速:4.5 mL/min;進樣量:滿環(huán)進樣6.4 mL;淋洗液:乙酸乙酯和環(huán)己烷混合溶液(1∶1，V∶V);淋洗程序:前淋洗時間12 min，收集時間15 min，后沖洗時間10 min;收集的溶液在濃縮腔中進行溶劑轉換，最后用1.5 mL乙腈定容。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱:Aglient Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm 2.1 mm ×50 mm)帶保護柱;流速0.1 mL/min;柱溫30℃;流動相∶甲醇∶水(95∶5，V∶V);進樣量:10 μL;檢測器:熒光檢測器，激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm。

1.2.3 標準曲線的建立

準確吸取0.5 mL苯并芘標準溶液用乙腈定容至10 mL容量瓶，得苯并芘標準中間液(1.0 μg/mL)，把苯并芘標準中間液(1.0 μg/mL)用乙腈稀釋得到 0.5、1、5、10、20、40 ng/mL 的校準曲線溶液，按照1.2所述方法進樣分析，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準品曲線。

2 結果與分析

2.1 凝膠色譜條件的確定

樣品通過凝膠色譜凈化，主要目的是將目標被測物與雜質分離開，提高檢測的準確度和精密度。由于苯并芘在紫外沒有特征波長，因此不能用過凝膠色譜－紫外在線分析確定收集時間。為了確定苯并芘的確切收集時間，采用分段收集的方法。由于油脂分子質量比較大，主要分布在前7 min的洗脫液中。在此之后，每4 min收集一管餾分，一直收集至35 min，共收集7管。收集的洗脫液轉移至旋轉蒸發(fā)瓶中蒸發(fā)至干后準確加入1.5 mL乙腈，混合1 min，過 0.45 μm 膜，濾液按 1.2.2 的液相色譜條件進行檢測。通過結果分析(圖2)，得到15－35 min的樣液中含有苯并芘，因此確定收集時間為12－27 min。

圖2 優(yōu)化凝膠色譜洗脫時間

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性

本方法建立0.50～40.0 ng/mL的標準曲線溶液，按照2.2.1所述液相色譜條件進樣分析后，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，建立標準曲線溶液(見圖3)。結果表明，上述標準曲線范圍內，相關系數R2=0.999 93，苯并芘與色譜峰面積呈良好的線形關系，符合歐盟2002/657/EC法規(guī)中R2＞0.99的要求。

圖3 苯并芘標準曲線

2.2.2 方法回收率

本文選取一個不含有苯并芘的植物油作為空白基質，加入苯并芘標準溶液制備加標樣本。考慮到植物油的限量標準10 μg/kg，本方法選擇了0.5倍、1倍和2倍的限量標準為加標濃度，制備了含量為5、10、20 μg/kg的加標樣本，按照上文所述方法進行檢測，共重復平行樣本3次，結果見表1。驗證結果顯示，該方法加標回收率在88% ～92%之間，符合歐盟2002/657/EC法規(guī)在5～20 μg/kg濃度下，回收率應在60%～115%之間的要求。

表1 方法回收率

2.2.3 日間精密度

精密度驗證采用2.2.2章節(jié)中相同的加標樣品，按照上文所述方法進行檢測，重復檢測3 d，每天重復平行樣本3次，檢測結果見表2。驗證結果顯示，該方法日間精密度在1.4% ～2.2%之間，符合歐盟2002/657/EC法規(guī)在該濃度下，日間精密度應小于16%的要求。

表2 日間精密度

2.2.4 靈敏度

考慮到植物油的限量標準10 μg/kg，本研究以0.1倍限量標準，采用空白基質加標的方法，配制1 μg/kg的加標樣本。該樣本按照本文上述方法進行預處理和檢測，色譜圖如圖4所示。該樣本的信噪比為167.28。以3倍信噪比(3S/N)所對應的樣品中標準品濃度為檢出限(limit of detection，LOQ)，計算得該方法的檢出限為0.018 μg/kg，以10倍信噪比(10S/N)所對應的樣品中標準品濃度為定量限(limit of quantification，LOQ)，計算出該方法的定量限為 0.060 μg/kg。

3 結論

圖4 樣品圖譜

本文所建立的植物油中的苯并芘檢測方法，與現有的國標(GB 5009.27—2016)相比，在樣品凈化、檢測方式上進行了改進。樣品凈化方面，本方法采用凝膠色譜法。凝膠色譜法可有效的去除樣品中的脂類、色素、蛋白質等大分子干擾物質，從而減小基質效應、降低分析背景、改善色譜峰行。且凝膠色譜從上樣、洗脫，濃縮，溶劑轉換到最后的定容完全實現全自動化，一方面可以縮減繁瑣的前處理工作，另一方面可以避免在前處理過程中帶入的人員誤差。在檢測方式上引入了超高效液相，相比于傳統(tǒng)的高效液相靈敏度更好，且檢測時間大大縮減，提高了工作效率。該方法簡單、快速、高效，為食用油中苯并芘的定性、定量分析提供了一種重要途徑。